诚心求教MDSC的分离培养

无知后辈

各位前辈，老师，师兄，师姐们，诚心向各位咨询关于MDSC的分离培养方法。7 }. r( ?. y6 W7 j0 n
从开始看到lacent上的关于人MDSC的文章到后来按照nature的protocol开始分离培养c56小鼠的MDSC已有半年多，种种麻烦至今未能养出该细胞，现在感觉压力颇大，遂在这里想各位求助，以下是我的培养过程：一开始困于I型胶原的购买和溶解，后来又遭遇CEE断货等等，我还是慢慢讲，第一次买的是一公司自称biosharp分装的源于sigma的来源于牛跟腱的I型胶原，但是经尝试在低温下或者常温，或者高温，以及将冰醋酸浓度增加到文献中的5倍左右都未能溶解，后来按照文章所述购买了sigma的来源于皮肤的I型胶原，经过三天三夜终于溶解，后来加入氯仿，后来发现这个东西离开4°C一会就呈现浑浊状，当然我每次都在它成浑浊状前久加入到培养瓶中，每瓶约3-4ml，放置一天后倒掉上清，但是我也没有看见胶状物，在显微镜下能看见许多小斑片状的东西（应该不是玻璃瓶底），后来CEE回来了，加入PBS振荡结果是浑浊液，后来试剂商告诉我这个可能是纯度不够高，但是需要的物质应该已经溶解了，于是我离心取了上清用来配培养基（当然对此我还是有所怀疑的），不过后来在配置培养基时发现很难过滤，所以可能是CEE溶解其中了，200ml培养基我用来3个滤器；现在到重点了，开始取材了，第一次取材因为操作不熟练，刚采取完就在400倍镜下看见有感觉像细菌杆菌样的东西，而且与我用同一只小鼠取材的骨髓间充质也污染了，所以没有继续培养，最让我担心的不是污染，倒是经过我的酶消化后，我在镜下没有看见我以前取别的材样的细胞，起码没有明显的细胞核，表示非常担心（这一次取材我是用0.25%的胰酶消化30分钟，0.1%的I型胶原酶消化了大约6个小时），然后我又进行了第二次取材，结合第一次的经验，这一次我增加了200目滤网过滤环节，按照看见的文章把胶原酶和胰酶的消化顺寻进行了调换，当我用胶原酶消化大约4h后，在镜下可见如图所示的细胞核（当然我没染色），而后又继续消化至6h，离心后PBS重悬后就看见消化的东西就像肉汤样浑浊状，然后胰酶消化了约30分钟，再拿到镜下看，就没有发现像细胞养的东西（感觉有很多漂浮的肌肉碎片还有一些像渣子样的东西），没有看见细胞核样的结构，但因为之前镜下见到了核，所以还是继续用差速贴壁法来分选，分选到PP4还是没有看见有细胞核的东西，而且整个液体一直是浑浊状（但是我个人觉得不是很像污染，因为400倍镜下也没有看见明显的细菌，而且这个静止后会变得比较澄清，晃动后会浑浊，而且与见过的污染的浑浊不是很像）。现在又要再次取材，有几个问题特别关切8 O% Q9 G! w' N2 V1 f
第一：也是最重要的问题，这个如图红色核所在的位置应该是MDSC的所在，如何把它分离下来，可以不用dispase（这个的价格实在是有点贵啊）？另外我也看见有文章中没有使用dispase也分选出来了。, ]+ v( I1 ]/ Q
第二：这个浑浊状是什么东西，可以去除吗？如何去除？, @: g6 K' S2 H) h
第三：这个细胞培养出来应该是什么样的，有人能传自己培养的MDSC让我学习下吗？因为我在国内和国外培养的细胞的形态貌似不是很像。
' m* {: t' `- B) }/ f9 g0 Z; e8 {8 t第四：有人能指导I型胶原包被的图片吗？
% D2 U; f3 ]+ R3 j- y$ Z恳请大家回答问题，非常感谢大家，非常非常感谢！

无知后辈

渴求各位的指导啊！

snickle

有没有可能是胶原酶的消化时间过长？因为你文中说用胶原酶消化大约4h后，在镜下可见如图所示的细胞核。

无知后辈

回复 snickle 的帖子( `% m2 M0 @( f: S

- z9 V; X9 E& H& J+ |. U嗯，我也这么考虑的，所以下次我会缩短胶原酶消化的时间，但是我觉得问题可能不仅仅是这个，因为我看见的时候它还在肌丝里，而且就算是酶消化时间长一点，也不至于一个细胞都没有啊，还是非常感谢你