老化问题

chenyuemily

这个老化问题我看了好多人都有这个问题，请问有什么办法可以避免吗？" Y7 [3 _1 d8 Q7 x8 t
我分析下自己的实验过程：首先，提取的时候由于后肢上有大动脉，我在分离出整条后腿的时候不可避免的会破坏大动脉造成出血，所以取完一条腿后动物就死了，然后再去取另一条腿，从开始取腿到种细胞全程大概用45分钟，不知道有无影响，大家是只取骨出来吗？动物不会死吗?! s  B# L. X7 h' `( I
其次，在冲洗骨髓腔以后，我的骨头就几乎是空的了，白白的，这样冲洗后会有一些碎骨或血块，可以在过筛后滤去，应该没有什么问题
& ^! Y" X1 n; F0 x. ]# i4 k接下来我的细胞是24h换液，之后的48h内每8h换液一次（根据nature的protocol），原代72h后有一些细胞贴壁，约5%视野中有细胞，之后换成3d一换液，到原代第8天左右细胞就到了80%融合，传代（0.25%胰酶，1分半消化，没有出现大家说的很难消化的现象，我很快就消化一部分，剩下的为非msc细胞就不要了）2 W4 J( ^1 D) f4 f
最后就是传代浓度了？我一般是1:3传，即104/cm2
% k/ n- B9 @- D, a0 z2 S9 A对我的问题大家有什么答案和建议吗？请分别回答！
1 p( p2 B  F' k, W

tangyvhuang

老鼠我一般是先弄死再取材，我觉得没有留活口的吧。换液次数太频繁了吧，24小时还有好多没贴下来的，虽然有文献说msc8个小时就能贴下来，我觉得那个不靠谱，我一般还是习惯48小时后第一次换液，然后就是观察生长状况，三天一换达到80%后传代。msc很好消化的，原代第一次传代不能消化太长，不好消化的是混在里面的咋细胞，第一次消化差不多就行了，第二三次要好好消化一下，

luther

同意楼上的观点。

wanglijing2011

回复 tangyvhuang 的帖子2 i7 E0 I( A9 O/ c4 P/ C- r' n3 a
; R8 B4 d( g( x/ W" Z
你好，请问你原代第一次消化细胞具体时间有多长，胰酶浓度多少，有没有EDTA，我消化小鼠原代细胞采用0.25％胰酶和0.02％的EDTA，是GIBCO的产品，消化3分钟，吸管稍微吹打，只有很少一部分细胞消化下来，但是每次原代传代以后细胞就变形了，变得扁平，在皿底铺开，基本没有立体感了，第二代第三代就很好消化了，同样的时间，细胞基本都完全下来了，不知道是否有同样的情况，请多指点，谢谢！

帝国黑骑士

我个人认为，在接种的时候接种密度也有很大的影响，密度稀的话也很容易老化！不光是，培养液啊，血清的 ，胰酶的原因！

不苦的药

回复 帝国黑骑士 的帖子
" u2 q. {$ |3 a9 A, x+ r1 V. y' g5 A% a; S
请问你的接种密度是多少

不苦的药

回复 wanglijing2011 的帖子' H; L* Z. Y, ]8 T2 O% c
" \* e8 w$ ~# c9 g
请问你“每次原代传代以后细胞就变形了，变得扁平，在皿底铺开，基本没有立体感了”这个问题是怎么解决的，扁平的细胞还可以进行诱导分化实验吗？我也遇到了同样的问题，你是怎么解决的，谢谢

wanglijing2011

回复 不苦的药 的帖子% S# `* O( e' R3 t3 u9 e0 `

" d, z  O  c* m) A1 a* A' f扁平的还在诱导分化，不过还没有鉴定，根据以前的经验，这种状态的细胞诱导出来的效果不怎么好，
  L) D( X; A' R9 v6 k* {4 C这个问题我也正在摸索，不同的培养基，胰酶，消化时间，传代密度和接种密度等，只是初步发现细胞形态不一样，DMEM高糖长得很快，不过细胞形态变化最大，扁平的最多，DMEM/F12长梭行的细胞多一些，DMEM低糖细胞长得慢，但是立体感是最强的，现在正在传代，不知道再传会变什么样，暂时提供不了解决方法了

不苦的药

回复 wanglijing2011 的帖子8 K( b5 V) O' g1 G2 u! b- c; x
9 p+ x* C4 V; A6 ?0 O
hehe我也在摸索