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1.抗体的选择
/ ^, G, ^1 F1 q( ^" w. M3 M4 J, d对于国内的大多数实验室来讲，做western blot实验选择抗体是个头疼的问题。原因很简单，买进口抗体捉襟见肘，买国产抗体得需要大无畏的勇气，对于我所在的兰州地区的实验者而言，感触尤深。在这五年的western blot实验历程里，我先后用过进口抗体，进口抗体国内分装包装，国产抗体，质量良莠不齐。
1 Y7 I* v# ]+ |8 V7 y进口抗体一般不会出现闪失：abcam品种全，质量过硬，但价高（3400元/100微升），而且说是100微升，但至多能吸出来90微升；Sigma的价最贵；比较有性价比的是CST的抗体，现在好像是2200元/100微升，我前后用过二十几种， 1:1000的稀释比下，还没有失过手，100微升通常能完成所有的免疫组化和western blot实验，还有一个优点是通常量比100微升多出来10微升，唯一的不足是CST的品种实在不多。Santa的多克隆抗体质量可以，但是选用Santa的单抗还是有风险，估计这也是业界共识了吧。0 Q8 l( G F1 N+ }+ l/ V0 O
进口抗体国内分装包装我也用过不少，呵呵，毕竟是穷人（420元/100微升），大概好抗体的比例约为50%，如果能做出来，也存在一个问题，就是抗体大多只能用一次。我曾经把Santa的原装抗体和分装抗体做过比对（抗体品种，货号等完全一致），在都能做出来的前提下，原装抗体能重复使用的次数要多出许多。具体原因我已经揣测了好几年，不敢说出来，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整个卖，也会有所不同。揣测归揣测，假如只为了发论文毕业走人，可以考虑选用进口分装的多克隆抗体。+ X0 d+ G# x$ @- u4 y3 _
国产抗体比较知名的就几家，但质量确实不敢恭维。western blot能做出来的确实不多，而且杂带多，背景不干净。我们周边的实验室大多买国产抗体做免疫组化，怎么说呢，应付硕士论文够了。- M9 R L! q. \# X, [$ I
我也帮别人自制过抗体，再用抗原亲和纯化。效价非常不错，夸张的时候1：10000都能做出条带，唯一的麻烦是兔子太骚（骚臭），不知道这是不是“兔女郎”名号的来由。如果读书非常悠闲，老板又特别想拥有手工作坊的情况下，可以自己伺候折腾兔子来玩玩，刚开始的时候还是蛮有成就感的。只是单凭抗原表达和制备多抗，是不是可以写成论文毕业，估计因校而异了。
, ~- m- F5 T8 ]8 l) @' A- N 2.Western Blot设备$ |/ }* A! C& E! r, {% j
目前最好的垂直槽和转移槽还是Biorad（伯乐），尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四块胶，但通常用不上，由此造成垂直缓冲液的浪费，而且MINI4用绿色塑料夹住玻璃板来组成内槽，容易漏液，塑料夹应该是有疲劳寿命的，估计日子一长，弹性就会改变，所以如果你们实验室刚买了MINI4，赶紧用，遭殃的肯定是某一级的师弟师妹们。
b* o; f# O; e% oBiorad的一套系统得两万多，西部能玩得起伯乐的还真不多。好在咱中国人聪明，上海天能的外观和构造和伯乐的MINI3几乎一模一样，而且可以通用，不带电泳仪是5千多一套，挺好用的。唯一的不足是塑料寿命不如伯乐，胶架容易断裂。不过仔细算算，三套天能也就是一套伯乐的价格，值了。北京六一的垂直槽很转移槽很好用，但垂直槽配胶不方便，玻板太厚，散热不好，但能用，六一的电泳仪（电源）还是很好用的。
1 L& _7 `3 V. }( X0 A: c4 i$ A4 X3. Western Blot实验条件# @6 d3 e% W, Q3 l( y
Western Blot实验条件我基本是按ABCAM公司经典教材做的，按以下的网址下载下来就可以了（http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf）。具体的试剂配方我是按宝生物试剂册的附录部分配制。丙烯酰胺和甲叉我是从北京华美买的德国biomol原装货，配出来的胶可以提在手里玩，弹性非常好，价格比sigma的便宜许多，1公斤好像是480多人民币，够实验室用好长时间，现在我们实验室做双向电泳都用biomol的胶，很好用。Marker我现在用fermantas 的SM1811,2微升就很清晰了，兰州的代理是上海生工。; N/ C" B. k) h; Z
要强调的是垂直电泳缓冲液千万不能回收用，具体愿因你只需上网查查SDS-PAGE的原理就知道了。转移电泳缓冲液可以回收再用两次。
9 m C% a) g) l9 C+ n4 r C4 E转膜我通常是快转两百200毫安/2小时，慢转80毫安/12小时。快转是一定得做冰水浴，就是把槽子泡在冰水混合液里。
. q! |1 t2 g7 U! ]9 A; Z封闭我通常用BD的脱脂奶粉，不归，260元500克，也是从北京华美买的。
8 M" H) m V$ \6 }ECL我用pierce的，500毫升1650元，比国产的还便宜好用。
( \6 g+ N2 ~, U5 {( u# }9 q胶片是柯达的，以前用过乐凯的，不如柯达。4 m+ w7 ^5 O4 W: ?& w
4. Western Blot实验关键2 m( T0 g8 M7 Y( i7 b! g
Western Blot操作步骤多，每一步的失误都会造成全盘失败，综合而言，抗体仍然是决定成败的关键，如果抗体很滥，就是神仙也没招。其中内参抗体很重要，因为内参抗体的选择关系到全盘实验的考评。Actin，Tubulin，GAPDH我都用过，Actin，Tubulin的缺点是有时候会出现复带，比较稳定的还是GAPDH。如果用心看看cell，nature，science上的文章，大多用GAPDH做内参。进口的，国内分装的，国产的，我都用过。进口的最强的1:10000都能做出条带（Upstate，现在被Minipore招安了），国内分装的也好用，但就是不好回收重复使用，国产的一般只能用一次。我要特别强调的是，实验室里最贵的抗体实际上是内参抗体，因为只要Western Blot开工，每次都得用内参抗体，而一般目的蛋白的抗体也就用几次，重复三次就了事。但内参抗体是不折不扣的耗材，严格意义上将，每跑一次胶，就得杂一次内参，使用频率最高决定了内参是最花钱的抗体。我也自己制备过内参抗体，但好像因为种属同源性太高，背景总是不干净。进口的好，太贵；国产的只能使用一次，年终算账，不比进口的便宜。我自己的体会是多抗制备并不是技术含量极高的事，为什么国内企业高的早不了，低的造不好呢？现在我用的是杭州贤至的GAPDH兔多抗，200微升420元钱，我在蛋白上样量12微升/孔的情况下，按1:2000稀释比，条带非常清晰，没有杂带，是我目前用过的最好的国产抗体，我估计按1:4000照样能做出来，因为按按1:2000稀释做，在暗室里点上ECL后肉眼清楚地看到荧光条带。抗体我在不加叠氮化钠的情况下4度过夜杂交，可回收重复使用5到6次。最早我是2008年在丁香通上看到了杭州贤至（当时名叫杭州松华）发布的广告，我就怂恿实验室主管买了2支，很好用，现在实验室都没有用完 ；2009年我的一个朋友做western，我推荐他又买了1支，做出来的效果确实好，2009年底我到了新的实验室，western的全套我在新实验室重新建立，啥都采购齐了，可就是买不到杭州松华的内参抗体，我上网再也找不到这个公司的网页了，没办法，只好一直噌朋友的内参抗体用。我有个陋习，就是实验中用顺了用稳定了试剂轻易不愿意更换品牌。还好，今年7月份我终于找到了当年的通讯记录，一联系才知道他们改名叫杭州贤至生物科技有限公司了，呵呵，改了个名，害我找了大半年。第三次买到的GAPDH内参抗体，还是好用，1:2000，条带清晰，回收重复用，照样work，截止目前，我的新导师对我采购的一堆试剂还没有不满意的，嘿嘿！草根出生，我也照样有我穷人的劳斯莱斯要别人制作引物其实是不好的，因为他不了解你的研究背景，很容易设计错误。所以最好自己做。那么我现在就简单的把设计流程和需要的工具告诉大家，希望大家对照着去逐步解决就可以了。 ' T. k# z$ y8 d5 S$ v8 f: T
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大家在找目标序列的时候，要注意一点，那些是你需要的真正的序列，因为有好多序列都是不可信，要具体看reference.一般NM的信度高一点。这个是关键。
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' I3 S* N; y$ _# y$ O' y还有，序列设计要注意三个工具的结合， . h: s* X$ z( |
第一是primer ' Z% j- {6 }$ R! W
第二是oligo ; U8 N3 Q) R+ t' t
第三是blast 0 \1 |7 l& Q) f, u
三个步骤下来结果都可以就行了。
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% {! H$ T+ G, G, ?/ T/ \# u" ]接下来就只要对着每一个工具使用就可以了。 / C. @4 v9 f3 g3 ^) {: Q
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至于具体的细节和结果的评判心得是要有一定经验的，大家可以在这个帖子里交流以下。 我感觉引物设计不能没有软件帮助也没有完全依赖软件。
$ s W$ ]1 X% w2 j3 \设计引物的时候最好能针对保守区，即使你手里的毒株跟GeneBank 上的毒株名一样，它们的序列也可能不同，所以就需要Blast，也可以用Bioedit ，比较起来很方便。 # F4 A9 v# ^0 }( G% t! V) _
根据你的需要选择好不同长度的保守区，长度还是短一点比较好，我感觉15－35bp 比较容易成功。另外，如果找不到完全保守的一段长序列，只要3‘端有8个bp 完全保守也是可以P出来片段的。在5’端可以加上一些酶切位点或调GC比。加酶切位点之前用软件看看目的片段本身有无你要加的酶切位点，如果有的话要避开。用primer就可以解决，oligo也可以。设计完之后呢就可以用软件看看有无发夹，二聚体，非特异性结合以及GC％，TM值等。用Primer 就可以解决了，用pcrdesn也可以。使用Primer5设计引物，是使用自动搜索的Pairs 还是编码链和反义链分别设计，然后给它们配一对？
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也有过这样的疑问。后来，自己做的时候觉得分开设计得出的排列组合比较多，可选择的多，看似更合理一些。讨教了高年级师兄和实验室请来的外籍老师后总结了几点：TM值最好在60左右，两条链越接近越好；产物长度要300以上比较好；当然还要注意引物设计原则中的3段不要有A，不可有连续的CCC或GGG，再结合primer premier综合比较一下就能找到满意的引物了。我的已经做出带来了。同寝室的同学也是照这样也做出来了。 5 K/ B6 L" _7 S* x! _& u G. \3 p
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发表于 2011-9-28 22:02
