关于反向PCR

yeya

我在反向PCR的时候，也出现过这样的情况。总是一段时间内可以P出很好的条带，但是有一段时间总是smear，也不知道是什么原因，很郁闷，只有不断换条件。我的经验是：1 感觉比较有用的方法是PCR后取少量样品跑胶，看是否是smear，如果是，那么把剩下的样品直接做PCR纯化（相当于胶回收），然后分别稀释成1：100,1：1000,1:10000等梯度，然后作为模板再次inversePCR；2 体系中加BSA；3 换酶，有时候可能Taq可以出，有时候用KOD plus吧，有时候在可以用KOD plus new，只要能出带就行；4 inversePCR很重要的是它的反应体系貌似太容易受到外界的影响了，很脆弱，稍微的改变都有可能P不出来，所以要做到：引物、dNTP、buffer等都分装成一次性的，P一次用一次，不要反复的冻融这些东西；引物一定要用两个月内的吧，不要太久；5 最后，P不出来那就把所有的东西都换新的，试试，我做的时候有一次把所有的东西都换了，结果就P不出来……唉，反正inversePCR很伤不起……有时候RP很重要，呵呵……% r( b% E9 s4 E

yeya

还想起来一点啊，你做自连环化的时候一定要16度过夜啊，用PCR仪做连接吧，哈哈，条件很苛刻……

yeya

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4 N. H  H8 `; G% C我以前4度连过夜，出来时smear……连好几天到没有试过……

yeya

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我没有那样试过啊，我是从基因组上PCR出片段，然后酶切后自连，自连产物都直接PCR了啊，自连产物你可以定量看看是否正常。要是你是从基因组上P出来的片段那么提取的基因组DNA好不好也很重要。

yeya

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不好意思，我记错了，我看了看以前的实验笔记，我和你一样先酶切基因组再自连成环，拿连接产物做PCR，也是要检测外源转座子插入到基因组的何处，通过gain-of-function或者loss-offunction的手段来获知位置基因的功能吧。我觉得你应该一步一步检查推敲寻找原因。首先，你提取到基因组后，时候跑胶检测过有没有含蛋白污染、纯度好不好，我记得我以前用一个比较烂的KIT抽genomicDNA然后reversePCR就不好，后来换了invitrogen的KIT结果挺不错。其次，基因组酶切后，是否有检查酶切图是否正确。酶切后是否灭活。再次，自连的条件时候合适，16度过夜连；最后自连DNA的提取是否合适，提取后对self-ligation的DNA定量看看时候正常；最后就是的inversePCR体系了，和我上面说过的一样，仔细检查。还有记得我说过的那个方法，要是出来smear那么把反应液直接胶回收，稀释后在inversePCR，这样肯定最后会有带，这个我也是从一个长做inversePCR的人的protocol那里学来的。P不出来就过段时间再P，还是那句话，有时候怎么P都是smear，再过段时间又好了。