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标题: 大家包装的慢病毒滴度是多少（不包括浓缩） [打印本页]

作者: runsong 时间: 2011-10-13 13:44 标题: 大家包装的慢病毒滴度是多少（不包括浓缩）

作者: tanguixiang 时间: 2011-10-19 16:17

太不专业了，单位都不提供，或者至少提供一些前提条件啊
我做钙转10ml/10cm，106IU/ml

作者: ying 时间: 2012-3-7 20:33

我差不多是10的6左右，浓缩之后基本达到10的8，凑合用～
转录本里面要是有miRNA什么的，会导致包装效率下降，因为有一些本来可以包到病毒里的RNA被裁减碎掉。如果没有会被剪掉的元件的RNA的话，要是比较小的插入片段，估计应该有10的7左右吧。

作者: sj03572001 时间: 2012-3-23 09:27

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7 v& i/ e; b1 U y
你好，我之前包的病毒滴度总是很低，我们实验室以前没有师兄师姐做过，我刚开始尝试，不知您能发给我一份你的Protocol 吗？我们实验室用的是Invitrogen的系统（PL1，PL2，PL-VSVG)

作者: ying 时间: 2012-3-24 23:19

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我是VSVG, delta-R8.91 和pGIPZ三质粒系统。我不知道是不是invitrogen的，因为是从我们实验室别人那里要的体系。protocol不方便给你原版，因为是别人整理的。但我可以说个大概。就是，用10cm dish 满的293T一盘传4盘（10ml培液），这4盘都不加双抗，培养24小时，大概达到50-80%覆盖率。这时候做个类似于lipo2000的转染，按标准的lipo的protocol转。就是一只管子加optiMEM和lipo，一只管子加potiMEM和质粒（VSVG:R8.91:pGIPZ=1ug:3ug:4ug，对于10cm大盘），之后混合，放置15分钟，再滴加到细胞里。12小时后换液换成有双抗的培液（DMEM加10%血清），之后36小时收一次病毒，再换液，再24小时后收一次。大致流程就这样。我觉得最关键的就是转染效率，建议你用个GFP的质粒先摸转染条件，主要就是lipo加多少，质粒加多少。效率要90%以上GFP阳性才行。7 w/ r8 u7 A: _7 t8 H; v( L. W8 v
如果你包装的是shRNA或者miRNA的序列，这种病毒滴度本来就不容易做的高，因为有些RNA自己会被切断，而没法包装成病毒。只有幸存的RNA才会包到病毒里。+ u. P; I: P) ~
祝顺利！

作者: sj03572001 时间: 2012-3-25 00:16

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U+ A. k7 n% @5 F
谢谢，我们的系统不一样，不过你的建议很有用哦

作者: huangcong1988 时间: 2012-3-25 09:29

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- p/ @! R/ d4 N! X
我的也是差不多10的6，浓缩后差不多浓缩100倍，但是浓缩后还要加入一定体积的培养基啊，这样不是等于又把病毒给稀释了么？

作者: ying 时间: 2012-3-25 14:52

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浓缩后加的培养基可以是你转染的对象细胞的培养基呀。如果你足够猛，就直接把这种浓缩过的东东当作培养液加到吸走培液的细胞里，那就浓到了极限了吧～

作者: salomemao 时间: 2012-3-26 23:39

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5 g* o& i. r, e( l0 }6 G* u) G
弱弱的问一句，为什么要在12小时后加入双抗的培养基呢？是你们本来养细胞的时候就是用双抗的培养基，还是转染后这样加的呢？谢谢

作者: huangcong1988 时间: 2012-3-28 08:32

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不是，我的意思是说，在你浓缩完病毒后，倒掉上清，底下沉淀里面加新鲜培养基，加了培养基之后把沉淀吹打混匀，然后再用来感染细胞，可能我没有表述清楚吧，我是说，加了培养基后，病毒不就被稀释了么？

作者: ying 时间: 2012-3-28 14:50

回复 huangcong1988 的帖子% p" E' |$ k1 U5 c. F0 r+ u2 J# }
( U/ Y/ A+ {' x* G, [" ^ H
按这样说来，确实是被稀释了。
不过，通常我是这样认为的:
一开始没浓缩时，假设体积是100毫升，
浓缩后，变成一个坨坨，; V, k J( f# B
把这个坨坨用1毫升的溶液给溶解了，
假设病毒没有损失率，那么就算是“浓缩”了100倍。因此用我的观点看，是“浓缩”了。

作者: ying 时间: 2012-3-28 14:52

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转染三质粒的时候，我们实验室的protocol是不加双抗的，据说双抗会影响我们的体系的转染效率。原因我也不知道。之后十二小时后我们认为质粒已经进到细胞里面了，所以再加上双抗防止污染。

作者: salomemao 时间: 2012-3-28 20:02

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你们平时养细胞的时候都是加双抗的吗？

作者: ying 时间: 2012-3-28 20:57

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是啊，让你见笑了：）

作者: huangcong1988 时间: 2012-3-29 10:05

本帖最后由 huangcong1988 于 2012-3-29 10:06 编辑

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100ml？这个离心起来怕是比较麻烦，您是在10ml（或者15买了，亦或者50ml）管里面一次一次离心弃上清么？一般来说，我们是直接15ml上清液（于50ml离心管中）离心，估计最后那剩下的一坨坨大概150ul，这算是浓缩了一百倍，然后再加1ml左右培养液，所以觉得最终只是浓缩了10几倍

作者: ying 时间: 2012-3-29 12:32

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我是用50毫升离心管，PEG6000和浓NaCl来浓缩，低速离心。一次可以离35ml，最后溶在400微升里面，扣除损失，估计浓缩应该在80倍左右。我还用超速离心法浓缩过，那个方法得到的坨坨很少，因为坨坨主要是血清里的蛋白，超离的时候很少下来。超离我是37毫升最后可以溶在大概200微升甚至更少。

作者: salomemao 时间: 2012-3-30 18:33

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; J8 T+ @7 ~2 O' Z6 w/ w. ]' d$ t
谢谢你的细心讲解，以后我们可以相互学习

作者: ying 时间: 2012-3-30 21:25

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: G) J1 |0 r- P' Q

作者: sunyuzhu10 时间: 2012-6-2 22:45

学习了，我总是包装不好，也是英俊的系统，不怎么看到荧光，大家说英俊的PLP1 PLP2 VSVG怎么样啊

作者: huangcong1988 时间: 2012-6-4 20:22

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我也是用低速离心来浓缩，不过我用的是PEG8000，50ml离心管，一般我是5mlPEG8000母液，然后加15ml病毒上清，然后离心。你一次离35ml上清液，那你不是包毒的时候要转好几个大皿么？工作量确实够大的。还有，你这个浓缩后的滴度我保守估计能到10的九次方左右，直接用？

作者: ying 时间: 2012-6-5 13:28

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5 V/ R- Q @8 q/ U2 Q* C9 O3 P
是的。

作者: 法号空智 时间: 2013-10-22 17:15

回复 ying 的帖子1 d- O, m( w- j. X' a6 x$ Q

很好的回复

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