慢病毒收集的问题

huangcong1988

我在转染之后24h收集慢病毒上清，然后提RNA，反转录，能扩得目的片段，但是提了RNA直接跑胶，没看到带，是浓度很低么？而且有个问题是，转染后一般多长时间收集病毒上清？期间需要给细胞换液么（比如说转染24h，或者48h之后）？我24h收集了病毒上清后，我又直接加培养基直接再过24h收集上清，这算48h么？

gact

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我很想知道你用多少  量的上清做的RNA抽提？0 F1 N4 k( K! G. y0 O( Y  f- m

' ~# y) I; z* q* }  d. KRNA抽提是用什么样子的试剂盒？6 s+ X$ }% r1 y  N6 i, y* x

huangcong1988

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1 }$ s! N1 Z: w& F/ A$ L! t4 `) R6 v6 h
RNA提取可以用试剂盒，也能直接用trizol，我用400ul的上清，你知道转染多少小时收集慢病毒上清效果比较好么？还有中间需要换液么？

naturalkillerce

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/ V$ G3 C7 ^! a' O6 R1 h2 B. t4 H- ^) I
$ ~1 t- B8 B& ?7 p8 f在提取前可以测量一下慢病毒的滴度，根据慢病毒滴度来决定需要多长时间来收集上清。既然RT-PCR能够扩增到目的片段，说明慢病毒RNA存在。之所以没看到带，很可能是RNA提取量本身就少，再加上提取RNA过程中内源性RNase(如果加内源性RNase抑制剂的话，宿主细胞也可能会产生RNase)和外源性RNase(很多细菌会产生RNase，所以提取RNA时，所有相关接触RNA的设备和溶液应保持无菌状态)的降解，最后就自然看不到了。所以可以通过测量病毒滴度来衡量何时收集慢病毒。另外在提取时，千万注意RNase防止对RNA的降解作用。) B8 j( D1 p' T0 z8 f& P8 ~
: m0 @& ~( a1 D- ~9 B
补充内容 (2011-10-25 23:23):
6 }( p' T" \4 P0 A. `3 U+ k4 M宿主细胞也会产生RNase，所以提取时应当加一些RNase抑制剂。

huangcong1988

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1 V- U& _4 X  C; L我是提了RNA然后反转录，然后测慢病毒滴度的，我的质粒不带荧光，所以只有通过定量来确定慢病毒滴度，你说让我在提取之前测慢病毒滴度测定，怎么测？而且我也不是做RT-PCR扩增到目的片段的，只是用普通PCR就扩得的

naturalkillerce

回复 huangcong1988 的帖子) C. Y. M. U2 [0 ]! V/ }

5 A5 Z. X. U( \& m

naturalkillerce

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6 d  ]1 w$ ?2 p' D6 a0 N. k) r
% v0 T6 F+ g+ b" q+ e! T$ c. W对啊，这就有些不靠谱啊，若是病毒滴度过低，用RT-PCR检测当然可以，因为这种方法只需引物设计比较好的话，可以扩增含量极低的RNA片段。只是提取后才能用RT-PCR检测，但是如果滴度过低的话，后续实验如何进行？所有最好的方法就是实验前测量滴度，可参照的方法就是点杂交测量病毒滴度的方法。) C$ ]8 V" I8 R& Z1 f- E. Y- Z0 Q

# g. o: B& k2 Z4 u) {2 o; f补充内容 (2011-10-26 08:51):, F- \6 E# D0 K7 p& \8 ~+ U
所以最好的方法就是实验前测量滴度，可参照的方法就是点杂交测量病毒滴度的方法。

christophe

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一般是转染后8-12h换液，然后转染后48h收集病毒上清，期间不用换液。转染后24小时收集病毒有些早，病毒才刚刚开始产生。

huangcong1988

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' u( y8 C, h" V) G4 U. W7 ]谢谢，但是中间不换液，细胞液全黄了，而且细胞没了营养怎么办呢？
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christophe

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没事的，细胞就只能受点委屈了，只有这样才能富集足够多的病毒。