瞬转后用puro/nero杀哪个好点

zzc2211

我是做肿瘤，不同细胞对puro的耐受不同，从25ng-500ng/ml都有，首先摸一下耐药浓度，48孔板，倍比稀释，可选加药后7天左右全部死亡的浓度做筛选，同样也是筛选7天左右。也有偷懒的办法，1ug/ml，3-4天或2ug/ml，2天。但个人经验后者不如前者，一筛全死的情况常有，而同样的细胞用第一种方法能够筛出来。理论上讲不过去，但我研究的蛋白就是如此。可能受转染效率，目的蛋白功能，细胞密度等等的影响吧。建议楼主还是摸浓度后再做。有时候偷懒的办法更费事。

zzc2211

另外转染后，细胞传10代，质粒一般没问题。超过此时间就难讲了。如果研究knockdown，理论上用高浓度，短时间的迅速筛选好一些吧。往往理论和实际操作有出入。

zzc2211

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筛选之后最好低剂量维持筛选，维持浓度可以倍比稀释摸一下，puro一般维持浓度在50-200ng/ml，细胞不会死。我们做慢病毒感染，不利于细胞原来体系的目的片段有可能被去除。即使低剂量维持，往往knockdown后传代10次，也不能确保功能维持。我们最终目的是研究功能，慢病毒感染后，多冻几支，每只能用3-4周，时间久了，和刚感染后的时间点相比功能有改变，就丢掉。因研究的目的蛋白不同，做法可不一样。根据蛋白在细胞的功能重要性，有些蛋白不维持也可。