我的小鼠骨髓基质干细胞正常吗？

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5 |6 A# `( ]2 F& j; w5 M! H图中蓝箭头所示应该是BMSC，而红箭头所示可能是未铺开的BMSC或其它杂细胞。
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从培养过程来看，我个人有几点小经验：, S- |4 s' `: E, i, \7 M

, G; D4 G0 N2 D1. 换液：首次换液应该在24小时之内，因为这时DMSC已经大部分贴壁，而其它杂细胞还有很多尚未贴壁。然后是3-4天进行一次半量换液。这里需要强调一下，时间是3-4天，换液方式是半量换液，因为细胞自己分泌的生长因子也是细胞自身生长所必需的，你如果换得太频繁，而且进行全量换液，那么你就相当于把细胞好不容易分泌出来的适量的生长因子给丢弃了，而让细胞重新进入一个新的生活环境，这样对细胞的生长事实上是很不利的。
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2. 血清浓度：不知道你原代细胞培养用的血清的浓度是多少，建议可以用10-15%之间，因为适当提高血清浓度有利于细胞贴壁和生长，而太高却也会加速细胞老化；传代后的细胞培养时血清浓度建议10%。
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3. 传代：胰酶消化的时间不要超过5分钟（我个人操作过程中，胰酶消化的时间通常2分钟内完成），胰酶消化传代一定要用血清终止，然后离心（1000g-1左右 离心5min），将胰酶尽可能处理干净。种细胞时，如果细胞是80-90%融合时进行传代，前几次次传代可以1传3（当然这还要视你取细胞的效率，是否绝大部分取下来？细胞损伤是不是不大？），第4-5代以后，基本只能1传2了，因为那时细胞个体变大，且生长能力下降，传稀会导致细胞长不出来。" _0 O: F1 o" D7 J; x

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bathpp2007 发表于 2011-11-16 09:55
& M; N. {( K/ e: g7 O9 x$ z谢谢您的热情指导！# r6 [. T0 t/ b* R- ~9 O: U
1.我是24小时换液，也试过8，48，72，感觉差别不大。换液却是全液换的，今天再做次 ...

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是原代细胞种下后24小时左右换液，保证大部分MSC贴壁，而不让内皮细胞贴壁，因为内皮贴壁时间通常在36-72h，而内皮的生长速率比msc快，然后3-4天进行半量换液。（也就是说，我习惯换液用半量方式，传代采用全量）% y! }. k7 C3 X) H
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传代后细胞可以不半量换液，不过，要注意种密一点，不然也不容易长出来。
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胰酶一定要去掉，MSC对胰酶很敏感，消化5分钟可能有点长，我常用的75cm培养瓶的消化方法是：吸弃原培养液后，用预热的PBS润洗3遍（要快速），第3遍润洗吸弃PBS时，留大约1mlPBS于培养瓶，然后加入1-1.5ml 含EDTA的0.25%胰酶（我用的是公司生产的胰酶溶液，不是自己配的），放入培养箱60-90s后，取出置显微镜下观察，如果有1半左右已经收圆，立即一手持培养瓶一侧，用另一手掌中等力度拍打培养瓶另一侧，交换拍打，反复几次（整个过程应该是10-20s），立即置于显微镜下观察，摇动一下培养瓶，如90%已在流动，立即加入1ml四季青血清（终止消化用Gibico的太浪费），晃动培养瓶，终止消化，将细胞吸至10ml已灭菌离心管，另往原培养瓶中加入3mlPBS，稍作吸打后也转移至该离心管，充分收集细胞，然后就于25摄氏度，1000g离心5分钟，弃上清，后面的操作就是估算细胞量和种瓶（注意不要种得太稀，MSC通常种得越密长得越快，但种得太密，传代就会太频繁，那也会损伤细胞）。5 _0 Y# ^; H+ k" Q: T8 n: B

0 ?" H5 t) z1 G* {* C+ A! `& ?( l建议不要用吹打的方式，用拍瓶的方式力量较均匀，细胞受损较小* a- |7 ^/ H/ {  j
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