关于免疫组化生物素问题

亮亮燕燕

大家好，我现在做的免疫组化的组织中还有较多的生物素，如果我用0.01%卵白素处理20min去除内源的生物素，我还能用ABC法做显色吗？还是只能用DAB-HRP显色那？谢谢

ilovelife

简单的回答：能。卵白素处理只是封闭内源性的生物素，不影响后面是的显色系统的选择。) s; j; [- x( j- G7 B
下面是我复制过来的别人的一篇分析总结文章，希望对你有所帮助。- L9 d- X$ |7 N+ c2 O( [

/ K0 J+ R- y5 ?: [9 s; c内源性生物素对免疫组化染色的影响及对策
1 n+ R: m7 [) J+ ~' m3 C2009/06/03 13:05# |- w5 w: N* V$ H

/ ^6 D' X; {4 }免疫组织化学技术的出现和发展给传统病理学带来了一场革命，使纯形态的病理学发展成为了形态与免疫信号相结合的现代病理学。在免疫组化技术的发展和应用过程中，加热抗原修复技术的引入，使在福尔马林固定和石蜡包埋时被封闭的抗原重新暴露，这样让很多单克隆抗体得以用于检测石蜡包埋组织的抗原表达，因此，在很大程度上改善和促进了免疫组化的应用和发展。然后，在加热抗原修复技术给免疫组化带来好处的同时也带来了“副作用”。并且，这种“副作用”至今仍未被人们充分认识。特别是当使用生物素-卵白素或生物素-链菌卵白素检测系统(如ABC法、LSAB法和SP法)容易出现假阳性。比较而言，人们对内源性过氧化物酶已有了充分认识，并采用了有效的过氧化氢法消除组织中的过氧化物酶活性，从而达到避免非特异性染色的目的，然而，国人对内源性生物素产生的影响知之甚少，几乎没有采取任何防范的措施。其实，内源性生物素对免疫组化染色的影响程度和影响范围远高于内源性过氧化物酶。最近的研究显示：(1)冰冻组织中存在内源性生物素；(2)经福尔马林固定石蜡包埋后生物素被封闭；(3)加热抗原修复可造成内源性生物素暴露；(4)内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中；(5)内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺上皮组织(包括正常组织和肿瘤组织)，亦存在部分非上皮组织；(6)内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增加依次为：柠檬酸pH6.0、EDTA pH8.0、EGTA pH9.0；(7)加热抗原修复暴露的内源性生物素可以被20-30% 鸡蛋清液封闭；亦可被卵白素—生物素封闭；(8)非生物素检测系统，如EnVision(丹麦DAKO 公司)、PicTureTM(美国Zymed公司)、PowerVisionTM(美国PowerVision公司)等二步法检测试剂，避免了免疫组化中内源性生物素的干扰。
4 ?+ c( D* s# ], h9 J8 a8 z　　　本研究结果显示，经修复后暴露的生物素可以完全被20-30%的鸡蛋清封闭。其原理是鸡蛋清中含有卵白素，卵白素与生物素有非常强的亲和性，二者结合后，封闭了内源性生物素所有结合位点，避免了内源性生物素与ABC、LSAB或SP检测系统中卵白素或链酶卵白素的结合，从而消除了内源性生物素的非特异性影响。
7 B, x2 l1 R/ b2 d8 y) M, M3 P　　早在1916年Bateman第一个发现鸡蛋蛋白中有一种有毒物质，直到1927年Boas才发现某种食物可以预防蛋白的毒性。之后的研究，即将此种可抗蛋白毒性的物质—生物素分离出来。生物素的结构于1936年被揭示，并于1943年即能在实验室中合成此种物质。生物素是一环状有如尿素的化学物质，具有一硫酚(Thiophene)的结构环，此种化学物质有八种同形异构物，但也只有右旋生物素(d-biotin)是存在于自然界中，并具有维生素的功能。生物素是一无色、针状的物质，稍微溶解在冷水中，较易溶解于酒精里，但不溶于有机溶剂中。生物素对热还算稳定，并不被酸或碱所破坏的。生物素以微量的含量广泛地存在于动物及植物的组织中，尤其在酵母菌、肝、肾中含量丰富。人体对生物素的需要量很难去定量在研究上发现食物中多余的生物素会从尿中排出，同时肠道中的细菌亦会制造出生物素。也许每天生物素的总摄食量约在150~300μg 之间。生物素在小肠部位吸收得很好，每一个细胞可以说均含有一些生物素，尤其在肝脏与肾脏组织中含量会更多。生的蛋白中含有卵蛋白(avidin)，此种蛋白是一种抗生物素的物质(对抗剂)，可与生物素结合，即不被肠道吸收，让它发挥不了正常的生化作用。好在若鸡蛋经煮熟后，即可破坏此种对抗剂，就不会造成营养上的缺失，故鸡蛋，尤其是蛋白，是不宜生吃的。生物素在糖类、蛋白质、脂肪等营养素代谢过程中，扮演着重要辅酶角色。在羧基化(carboxylation)反应中，生物素与二氧化碳形成活性物质—carboxy-biotin；在植物界中，生物素亦可进行下列的反应：丙酮酸(pyruvic acid)的羧基化，合成草醋酸盐(oxaloacetic acid)，将丙酸(propionate)经甲基丙二酰辅酶A (methyl malonyl Co-A)而转化成丁二酸盐(succinate)；其它涉及的辅酶可能还有乙酰辅酶 A (acetyl Co-A)，巴豆酸辅酶 A (crotonyl Co-A)，及丙酸辅酶 A (propionyl Co-A)等；在某些氨基酸降解作用中，发挥转羧基的作用，如白氨基酸及异白氨基酸；在脂肪酸要形成更长的键时，能将乙酰辅酶 A (acetyl Co-A)转化成丙二酰辅酶 A (malonyl Co-A)；从鸟氨酸 (ornithine)与CO2来合成尿素(urea)时，可能形成瓜氨酸 (citrulline)当做中间代谢物质；也可能参与卟啉(purine)与嘧啶(pyrimidine)等的合成；也可合成天门冬酸(aspartic acid)。皮肤、指甲、爪等角质化需要生物素，否则可导致角质化不全，指甲、爪等脱落。2 K8 @# ]; W4 w, Z1 Y7 ~# s) w
   生物素的功能包括：1. 细胞的生长；2. 脂肪酸的生长；3.蛋白质、脂肪、碳水化合物的代谢；4. 维生素B群的利用。协同作用的物质有：1. 维生素B群；2. 维生素B12；3. 叶酸 (folic acid)；4. 泛酸(patothenic acid)；5. 维生素C；6. 硫 (sulphur)。拮抗作用的物质有：1. 酒精；2.咖啡；3. 生蛋白。
! b6 \, ?0 P. r0 R7 g* }　　　生物素在代谢旺盛的、线粒体丰富的细胞中含量较多，因此上皮源性细胞和肿瘤细胞容易出现生物素阳性反应。这些假阳性反应极易被当做特异性反应看待，从而影响结果的判断。所以，在实际工作中如果见到胞浆中有阳性的棕色颗粒，应考虑到内源性生物素的可能，有条件的话可做进一步确证。" L" o. T4 _; P7 k3 F5 C, c
　　针对这种情况，我们建议采用以下各种方法来避免内源性生物素的干扰；
; A, }9 v5 j% M　　1、如果使用生物素标记的检测系统，可以在使用检测系统之前先用20%~30%鸡蛋清液对内源性生物素进行封闭。具体做法是取1个蛋清，加入100~125毫升的蒸馏水，此种溶液在4℃冰箱中可保存1~2个星期。
" w3 n1 }, M5 {! J　　2、采用非生素标记的检测系统，从根本上去除内源性生物素的干扰，如上述提到的二步法检测系统，已经成为一种必然趋势。

亮亮燕燕

非常感谢！我做的是肝脏组织，那就是说如果我用卵白素去除内源性生物素后，就能用含生物素的系统显色了，不知道生物素能不能去除掉？那我如果选择HRP系统显色会不会好一点呢？请指教!