流式抗体荧光淬灭现象疑惑

gact

做了流式发现应该阳性的却没有发光，无信号；" y( G% z6 i6 M8 z7 l% N  Y5 U
固定后放在冰箱过夜，大约10h后上机，影响荧光信号么？$ G" w- ?* r$ n
染料为APC、percp710；
/ V9 L) v) u0 g2 \3 A- M# L, y6 X7 z' w而PE却能正常是阳性；, J- z# y* p0 p0 J
请教原因，，
3 D6 U# K* `9 w/ a! H% ~! [2 G1 e- |谢谢！

gact

CD90 CD105 CD73三个抗体% W% X- I2 X4 e6 H- N
胰酶消化，洗涤液洗1次；) D! \! M$ p- X5 b. P* Q  B8 y
加抗体，2 ~, A- f( G/ Y) @& t
洗涤液洗2次，离心加固定液上机

Temin

原因是有很多的，我们一般是荧光抗体孵育大约30mins后，PBS洗2次，就上机了，没啥问题，从来没试过过夜这样的条件。也可能是细胞本身没有表达相应抗原，或者你的抗体抗原不能配对。。。。

wangzhiqi86

回复 kgx1986 的帖子$ H! |. m2 p* w
  m. i; T$ g  ?( T- m5 F
抗体稀释液：0.1% 叠氮钠，1% BSA溶于1×PBS（pH7.0），是稀释抗体作用的，4℃避光半小时，每隔10min敲打一下

kgx1986

回复 wangzhiqi86 的帖子: b' O$ H1 I* x! L! D3 @" F; G
( A0 B2 `1 A. w! }) L7 O$ C& h
请问抗体稀释液是指管内需要加抗体的细胞悬液吗？一般情况下你4℃避光孵育多长时间？隔多长时间敲打一下呢？

wangzhiqi86

回复 leisong12 的帖子; e( Z1 A; J, r2 @8 B3 ~" E
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由于标记加入的抗体很少，所以每次抗体稀释液洗涤之后，要留少量液体，再加入抗体，充分混合，4℃避光时，要隔一段时间就去敲打一下，因为细胞多，液体少，细胞过几分钟就会沉淀下来，敲打可以让它混合的更均匀，接触更好

leisong12

回复 wangzhiqi86 的帖子
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哪些关键的地方，能否具体谈谈，多谢分享

Tonypan

楼主确定标记的抗原表达嘛？多高？

wangzhiqi86

楼主就这么肯定是荧光淬灭了？会不会有其他的什么原因。流式标记完后，4℃冰箱可以放几天，我经常是隔两三天才去测的，之前也是测不出来，后来发现是操作的一些关键地方没注意

luozhen1018

原因有很多：抗体是否有效？抗体有效的前提下，就是你操作的问题了。比如抗体加入量，孵育时间，洗液的使用等等。孵育好抗体后，最好尽快检测。我个人觉得，固定后检测效果不是很好。