求高人指教啊！关于iPS诱导方面

YLL824WAN

小妹刚开始做iPS方面，又没有师姐和老师的指导，所以糊里糊涂的，看了一些文献，还是有很多搞不清楚啊！还希望各位高人在此多多指导一下哦！谢谢啊！（1）就是在诱导iPS过程中，用病毒转导靶细胞后三天左右孔板就长满了，要用什么消化传代呢？我上次用胰酶消化的，之后去看荧光，背景全是绿蒙蒙的很模糊；（2）病毒感染靶细胞后大概多久要换成hES培养基呢？（3）什么时候把转导后的细胞种于MEF饲养层呢？是要等克隆出现之后挑克隆吗？克隆大概会多久出来啊？多谢高人赐教啦！感激不尽啊！

song58

个人经验：3 f' q& o) K% S
1、胰酶消化+ i: `5 C  }! n& w0 I
2、接到feeder上就能换hES Medium8 n. |9 _6 u3 F: @8 h3 j/ A
3、看细胞状态，通常不超过6天，有时候两天就上feeder了。最好是把克隆挑出来，否则用酶消化再接到新板子里时杂细胞太多，影响克隆生长。OSKM的话一般要20天左右能看见克隆。* |2 N9 T* {$ Z6 G  i/ R! h! N
2 q0 Y& P4 H& i0 `4 y/ [& H
希望我的经验对你有帮助

YLL824WAN

song58 发表于 2011-11-28 16:25
. d+ G& X( ~5 R+ h% L" B$ B个人经验：
5 c, z$ p2 y( U7 J% u. W1、胰酶消化4 ?% u: t9 P! \# P
2、接到feeder上就能换hES Medium

. D* O& c, p& l) u& }你的意思是说，病毒转导靶细胞不超过6天，也就是克隆还未形成时就用胰酶消化后种于MEF饲养层上，等克隆出现了再挑出来养，是吗？

michaelgibh

病毒感染第二天将培养基更换为DFBS培养基，感染第五天复苏饲养层细胞，感染第六天用0.05%胰酶消化后计数，感染后第22天~30天挑克隆

song58

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! w& }5 w. e; l2 a. y) V/ {- b
; S" ^) R. M- w. a- G是的。

YLL824WAN

回复 song58 的帖子" D1 ^# U2 Y* x) B4 e
, G& O: P3 Y8 L8 ]
好的，多谢啊！呵呵

song58

回复 YLL824WAN 的帖子3 |+ J6 A) Z! c5 v

2 I) q. e0 h3 {: ~/ [" E/ U$ y嘿嘿
  O3 @) e0 M; u不客气

YLL824WAN

回复 song58 的帖子! U6 }) w: O7 o4 R' ~2 s" d4 z

) d+ g, k, @- _# n! ?对了，还想麻烦你一下哦！想问问你用的是什么hES培养基啊？是不是所有iPS培养都需要用MEF饲养层啊？我买了mTeSR培养基，听说好像可以用BD matrigel养而不用MEF饲养层，但我又不敢确定，所以想再请教一下啊！多谢多谢啊！呵呵

song58

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* A0 \2 y- x2 m( x' a; D5 y6 x4 d5 Z' ^" u2 ?# x" k
我用的hESM就是最普通的：DF12，KSR，NEAA，Glu，2-Me，bFGF。有时候加双抗，bFGF有时候从4加到10～20ng/ml。' W+ M! K2 e  C7 G( T
mTeSR是加拿大StemCell公司的产品，和Matrigel联用就不用MEF了。但是我个人感觉，这个培养体系养成系的细胞（比较皮实）应该没问题，做iPS我就不知道了...
" u3 ]7 I$ M% W5 `9 b6 M另外，我做过的iPS都是靶细胞过量的情况，多余的靶细胞就相当于feeder了，而且克隆挑出来也是直接往feeder上接，还真没尝试过feeder free的做法。你试试，结果到时候跟我们分享一下呗:lol

jefferson

首先不清楚你用的什么病毒诱导的, 慢病毒还是逆转录的; 其次不知道你感染的什么细胞, 种属, 类型等等, 不同种属, 不同类型的细胞, 诱导过程和方法都是有区别的...4 p, [$ G1 {& x8 e+ A

8 B% Z3 x* I$ V# V" p" }( p8 t以逆转录病毒进行感染诱导人的皮肤细胞为例说下个人意见吧.+ p) r* i& a2 ]2 G; z$ t) |
1. 诱导时起始细胞, 即HDF细胞的接种密度对诱导的成功率很关键. 不能种的太密, 按你的说法, 感染后两三天就长满了, 考虑是否是接种过密了. 即便你是参考的文献报道数据, 也要考虑是否你细胞计数存在较大误差. 因为目前主流的Protocol都是建议感染后第6天转到MEF上, 也就是说, 之前这6天是不需要传代的. 而且有报道, 前面几天中细胞间的接触产生的信号转导, 对iPS的诱导是有利的. 如果你的细胞增殖能力很好, 你多次计数没问题, 用的文献报道数目接种, 依然很快就长满了, 就需要考虑提前接种至MEF上, 因为太密的话细胞就开始凋亡了. 不过一般都建议第6天用胰酶消化后计数接种MEF.
  F) U7 i) Z$ }3 `- i# @
8 R1 g! N9 X, h7 r' b; n: _" w- _" Q2. 看你采用的是哪个Protocol,  这里的方法也有很多种的, 大多人在第六天接种MEF后就换ES培养基, 7天后由于MEF可能已经不行了,后续采用条件配养基进行诱导培养, 直至克隆出来; 也有其他的方法, 如裴端清教授实验室的Protocol, 接种MEF后就用称为DFBS的培养基培养大概18天, 再换ES培养基. 如果你刚开始做, 严格按照Protocol进行.
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* ^& _2 E: @8 ^, q: {6 c5 ~3. 如第一点, 一般建议第6天转MEF, 有的方法里, 用四因子诱导最早可以在第9天就看到出现细胞团的隆起, 14天左右就有克隆出现, 20多天就能挑克隆. 如果用三因子(去掉C-Myc), 效率和克隆形成时间都会降低和延长. 诱导过程中, 建议持续培养至挑克隆, 中间不进行传代. 如果发现MEF不行了,就用条件培养基进行培养.