求高人指教啊！关于iPS诱导方面

YLL824WAN

小妹刚开始做iPS方面，又没有师姐和老师的指导，所以糊里糊涂的，看了一些文献，还是有很多搞不清楚啊！还希望各位高人在此多多指导一下哦！谢谢啊！（1）就是在诱导iPS过程中，用病毒转导靶细胞后三天左右孔板就长满了，要用什么消化传代呢？我上次用胰酶消化的，之后去看荧光，背景全是绿蒙蒙的很模糊；（2）病毒感染靶细胞后大概多久要换成hES培养基呢？（3）什么时候把转导后的细胞种于MEF饲养层呢？是要等克隆出现之后挑克隆吗？克隆大概会多久出来啊？多谢高人赐教啦！感激不尽啊！

song58

个人经验：2 j5 p+ i1 c; v* `/ M, }0 r" e) |
1、胰酶消化
: W# E6 |3 r/ g1 R" q2、接到feeder上就能换hES Medium
+ L0 @2 z0 ]7 J/ I) K2 m3、看细胞状态，通常不超过6天，有时候两天就上feeder了。最好是把克隆挑出来，否则用酶消化再接到新板子里时杂细胞太多，影响克隆生长。OSKM的话一般要20天左右能看见克隆。, g- k3 z, `7 T! ?
6 `# }9 [  w+ t9 S7 M  a
希望我的经验对你有帮助

YLL824WAN

song58 发表于 2011-11-28 16:25 : q/ K7 q2 T3 M. f# D& R+ }
个人经验：
% n  _+ V6 d; J, w4 v. x# O. p1、胰酶消化! K7 U  ]! O% e
2、接到feeder上就能换hES Medium

( s) v0 n! i7 y- M) F. H7 C你的意思是说，病毒转导靶细胞不超过6天，也就是克隆还未形成时就用胰酶消化后种于MEF饲养层上，等克隆出现了再挑出来养，是吗？

michaelgibh

病毒感染第二天将培养基更换为DFBS培养基，感染第五天复苏饲养层细胞，感染第六天用0.05%胰酶消化后计数，感染后第22天~30天挑克隆

song58

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$ i3 x" G& H' [' k" w8 }) |
是的。

YLL824WAN

回复 song58 的帖子+ y1 J+ C" }* w# \: Z# b
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好的，多谢啊！呵呵

song58

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1 N5 v% J! P( @# U, _) h/ h( D5 [# h! U: b. l
嘿嘿: y1 h2 T6 j0 [; i5 H
不客气

YLL824WAN

回复 song58 的帖子; `/ X# s+ H3 A6 @
) g( y, A* E, E& h- V) h3 O) Q
对了，还想麻烦你一下哦！想问问你用的是什么hES培养基啊？是不是所有iPS培养都需要用MEF饲养层啊？我买了mTeSR培养基，听说好像可以用BD matrigel养而不用MEF饲养层，但我又不敢确定，所以想再请教一下啊！多谢多谢啊！呵呵

song58

回复 YLL824WAN 的帖子* ^2 f# N$ X# a( ], G" M, _' ?
0 \1 y. Z. G+ {2 ^
我用的hESM就是最普通的：DF12，KSR，NEAA，Glu，2-Me，bFGF。有时候加双抗，bFGF有时候从4加到10～20ng/ml。9 Z: F* Y2 _8 ?
mTeSR是加拿大StemCell公司的产品，和Matrigel联用就不用MEF了。但是我个人感觉，这个培养体系养成系的细胞（比较皮实）应该没问题，做iPS我就不知道了...
5 c% ~" [% N5 K( C0 p7 b& N0 P另外，我做过的iPS都是靶细胞过量的情况，多余的靶细胞就相当于feeder了，而且克隆挑出来也是直接往feeder上接，还真没尝试过feeder free的做法。你试试，结果到时候跟我们分享一下呗:lol

jefferson

首先不清楚你用的什么病毒诱导的, 慢病毒还是逆转录的; 其次不知道你感染的什么细胞, 种属, 类型等等, 不同种属, 不同类型的细胞, 诱导过程和方法都是有区别的...$ X) \( D% H, c8 U. {
' {) _: [5 H) n3 v- R
以逆转录病毒进行感染诱导人的皮肤细胞为例说下个人意见吧.) X# S& K- f+ L7 M& E
1. 诱导时起始细胞, 即HDF细胞的接种密度对诱导的成功率很关键. 不能种的太密, 按你的说法, 感染后两三天就长满了, 考虑是否是接种过密了. 即便你是参考的文献报道数据, 也要考虑是否你细胞计数存在较大误差. 因为目前主流的Protocol都是建议感染后第6天转到MEF上, 也就是说, 之前这6天是不需要传代的. 而且有报道, 前面几天中细胞间的接触产生的信号转导, 对iPS的诱导是有利的. 如果你的细胞增殖能力很好, 你多次计数没问题, 用的文献报道数目接种, 依然很快就长满了, 就需要考虑提前接种至MEF上, 因为太密的话细胞就开始凋亡了. 不过一般都建议第6天用胰酶消化后计数接种MEF.
5 A- D  B0 e7 I* B% x, R' D4 N& \4 C, v) Y) y
2. 看你采用的是哪个Protocol,  这里的方法也有很多种的, 大多人在第六天接种MEF后就换ES培养基, 7天后由于MEF可能已经不行了,后续采用条件配养基进行诱导培养, 直至克隆出来; 也有其他的方法, 如裴端清教授实验室的Protocol, 接种MEF后就用称为DFBS的培养基培养大概18天, 再换ES培养基. 如果你刚开始做, 严格按照Protocol进行.# l  z, X# e+ Z& Z

9 |$ U; `3 W: t, w% C" O8 ^, L3. 如第一点, 一般建议第6天转MEF, 有的方法里, 用四因子诱导最早可以在第9天就看到出现细胞团的隆起, 14天左右就有克隆出现, 20多天就能挑克隆. 如果用三因子(去掉C-Myc), 效率和克隆形成时间都会降低和延长. 诱导过程中, 建议持续培养至挑克隆, 中间不进行传代. 如果发现MEF不行了,就用条件培养基进行培养.