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标题: 第一次养MDSCs [打印本页]
作者: 87hgl    时间: 2011-11-30 10:34     标题: 第一次养MDSCs

这是我我第一次养MDSCs的步骤，当然以失败告终，准备明后天接着做，希望大家指出不同意见。
- V8 c& \  D0 J7 V' g* x3 a/ l将SD大鼠，4-6周左右，腹腔麻醉后取出小腿处肌肉，好像是腓肠肌，很少一部分，没有称重，大约1g左右，放入无菌盛有D-Hank‘s液的培养皿中，去除其他组织，再转入另一个培养皿，用组织剪剪碎，约有1mm^3，用D-Hank‘s液冲洗，转入试管中，D-Hank‘s液吹打冲洗3次后，800转/分  2min，去除上清液，加入Ⅰ型胶原酶（1%浓度）2ml，37℃水浴消化约40分钟，其中每10分钟取出进行吹打，最后一次进行滴片在显微镜下观察，看到许多条索状组织，未见细胞，然后加入适量D-Hank‘s液，吹打几次，2000转/分  10min，去除上清，加入Dispase Ⅱ（2.4U/ml）2.5ml，同上进行37℃水浴消化，约40min，滴片观察，可见细胞团块，单个细胞少见，上述条索状组织变少，变小，加入适量D-Hank‘s液，吹打几次，2000转/分  10min，去除上清，加入0.1%胰酶2ml，通上37℃消化40min，滴片观察可见单个细胞，圆形，细胞团块少见，加入胎牛血清终止消化，2000转/分  10min离心，加入D-Hank‘s液约有6ml，进行细胞计数，约有3×10^5个，1000转/分  8mim离心，去上清，加入生长培养基3ml（20%胎牛血清  10%马血清  1%双抗 DMEM）转入多聚赖氨酸包被的6孔板中进行差速贴壁培养，1h为PP1，转入下一个空2h为PP2，再转入下一个空18h为PP3，再过24h，观察细胞没有贴壁的，细胞也较少，最后实验室老师说细胞死了，就倒掉了~~~
作者: jhu132llh    时间: 2011-11-30 10:46

猜测可能是胰酶消化过度了
/ i' I: L& _7 B. b+ B胰酶消化40分钟太久了2 H" U; n/ c9 x: [9 T3 M+ f' a
估计很少有细胞能顶得住
) G. v. n: i1 b" r建议胰酶消化后计数时看一下细胞活性& e. d8 V6 R% W" V* K
作者: 87hgl    时间: 2011-11-30 11:03

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  O4 T: k" b. e" f
  o! `8 Q8 f7 Y( \那问一下胰酶一般消化多长时间？怎么检测细胞活性？
作者: mhqh    时间: 2011-11-30 11:48

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3 n+ o. `4 M0 d4 \$ u) {8 f
- B' c6 p) Z1 U, s* y你好！ 我收到了你加好友的请求，但是我没有权限加你好友。我甚至没有权限在你的空间里留言或者给你发送消息。我很伤心，不好意思啦。
作者: dianying    时间: 2011-11-30 11:56

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3 w) @4 q( w0 L  o/ N  M
. T) ]. y# E- e  s, i# f* u& k+ U最简单的看活没活可用计数板检测.
- D( D: q" e' }# H3 W+ L10ul trypan blue and 10ul cell culture, load 10ul in.
  R% ~2 {& A- J3 l  J: g. ~亮的就是活的，按方格数数再算量。
作者: 87hgl    时间: 2011-11-30 15:05

回复 dianying 的帖子. P, `; L9 i4 O7 T# k
8 R/ p% I' h& R0 [$ S2 ?' `/ f+ h
谢谢
作者: 细胞海洋    时间: 2011-12-1 01:48

回复 mhqh 的帖子
' T6 A# V' D9 p  Q$ ?+ m" u7 c# y, ^  B* H8 K4 x. V
积分达到50才有权限 抱歉了 多参与讨论吧
作者: jhu132llh    时间: 2011-12-1 10:55

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% F" S6 @1 e6 T
9 `9 l: Z$ E2 w0 o* Y& I0.125%的胰酶普通细胞消化2-5分钟，克隆一般消化5-10分钟
2 L; J/ V& A! @4 v1 }1 s检测细胞活性很简单呀% \+ b% m/ }7 B7 P
你细胞计数的时候不是要加4%的台盼蓝吗
2 O4 }% ^8 ~) d9 G4 e; e你观察细胞染色情况1 x$ S! U0 k$ G2 A( B3 `* x7 H- e
排斥台盼蓝的细胞即为活细胞
作者: mhqh    时间: 2011-12-1 13:40

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, g# G" `* @+ r7 |( H/ r! P哦，好吧，我有好几个师兄在做细胞啊蛋白质啊金纳米粒子啊载药啊什么的，我以后向他们多学学...



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