如何把siRNA转换成shRNA？

sarah19860420

我已经在数据库里找到了我的siRNA,现在的问题是我怎么把siRNA转换为shRNA。在丁香园里的帖子有人这样回复。1 w: I7 b; h1 u7 K/ p( F
3 ?& [7 T8 P8 s/ t6 M9 _
两端设计好酶切位点
' ^" M( o( }+ a" e1 p基本结构是 酶切位点-干扰核心序列-Loop-干扰核心序列的反向回文序列-酶切位点." S/ J0 w( l; P4 E9 o9 H& c/ ]0 c' [, R
中间loop可以用TTCAAGAGA的9个碱基序列) ?0 Q, Y; `+ X( ]8 L0 ]/ x

3 R/ \! O+ q3 |0 e1 u. Q* X我想问下这个loop的序列是如何确定的呢？

cneagle66

为什么用这么长的loop？我记得有人用4个碱基的loop。

歪歪

invitrogen 有试剂盒
' H2 v! c! s: M7 NpSilencerpsilencer-4_1-cmv-neo-vector-map

sarah19860420

回复 cneagle66 的帖子
# D, U5 u8 I: j7 d4 t- h2 a' e6 }6 a; [* ~
昨天看文献，见了一个更长的loop 大概有20bp左右。

sarah19860420

回复 歪歪 的帖子) A* M2 C3 N- E$ \- ~' i

8 T! E; {/ d/ P( i2 r关键老板不给用试剂盒啊。

白色的风

forward oligo：酶切位点+G+siRNA+loop+reverse compliment sequence+TTTTT
5 V0 J, ^& R- h9 V, Kreverse oligo：酶切位点+AAAAA+reverse sequence+loop+compliment sequence +C* S" z$ `% K: u& O
我有一个clotech pLVX-ShRNA2空白质粒，可供构建ShRNA,loop我们通常采用9nt的，这个效率比较高

sarah19860420

回复 白色的风 的帖子) q  f9 k8 p' s: `: y6 F. M- d# W2 l

: Q7 G# O$ ?5 y3 ^加T的数目是5个是固定的吗。加T为了终止，对吧。但是加G是什么意思呢。还有就是loop的结构9nt是我上面写的那个序列吗？这个loop结构没有种属特异性吗？我的空载体是PLL3.7。听说过吗，好用吗？

sarah19860420

回复 白色的风 的帖子+ R4 a& H& |& A, L  M) r! {0 c8 G

- I% g$ k2 V# s1 V酶切位点还必须是切开那个后剩下的那段序列，不能是酶切位点的完整序列，对吧？便于直接连到shRNA的空载体上，对吗？还是多一步PCR后，先连接到T载体？

白色的风

加G是因为我的启动子是U6 Promotor，它要以G为识别位点来启动ShRNA序列的表达的，酶切位点是切开后剩余的那段序列，不是完整的序列，合成两个oligo直接加热退火变成双链DNA，可以和酶切后的载体直接连接；pll3.7这个载体挺好用的

sarah19860420

回复 白色的风 的帖子+ U5 @" n- y& l* v. z0 [

" Y9 G5 Y( |  U% V, z3 c* F你好，谢谢你热心的回答。 我的启动子也是U6启动子。然后我的siRNA是以G开头的。那还需要加G吗？我已经查好了siRNA序列，那我是不是直接把我的siRNA序列加到你的公式里就可以呢。还是有其他要注意的事项。求解，(*^__^*) 嘻嘻……
: B7 k7 x8 _9 m) F# }: m7 @8 ?