急 加急 火急

cneagle66

95℃ 5 min, 然后每降低1℃保持90s, 直至降到30℃, 维持30min, 随后再降至4℃后, -20℃保存。

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方法二
( ~# U. f8 S5 r0 e& x* X# C* X9 m1.退火。退火buffer：10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA。& D. i' K  T9 A
退火体系：两条寡核苷酸片段各2µl(1µg/µl)，1×退火buffer 46µl。
& ~0 t( l3 Q2 b3 Y6 c95℃ 5min,然后自然冷却到室温。; s- p7 b9 F7 b& `* }& ^
2.载体酶切，回收（按照正常）- m8 t1 G5 O' a, K+ d
3.连接。
  l3 U6 R: @, e9 |) B1 [
- ]# n) @1 d) c9 r: y方法三# P4 [# w; J; @2 r( C% x5 w
退火条件（供参考）：3 D* U, U$ K6 }2 [
99℃ 2min3 `& X  F' ~( }! D( n. L, I
72℃ slow down 30℃ 90min
3 H- n- C: ?9 [$ {6 d% y4℃保存6 M  R  |; P& D1 e* R# B