新手求教：关于全骨髓培养法的几个问题

amney1

感谢各位前辈光临此贴，小弟有几个问题想请教：
1 s1 M+ V4 G6 b4 Z; ~$ N1.分离股骨、胫骨的时候需要把肌肉去除到什么程度？如果有少量残留会对采集细胞造成污染吗？
- x& }  [! q% R8 s. l# ^+ M: {2.和第一个问题相关，为了尽可能去除肌肉，我的刮骨时间较长，会因为凝血等影响收集吗？我大概要花1~2小时。
8 O! M" ^& y; Z; e; I+ u# h7 H+ i2 C3.大家的间充质干细胞在使用前都作了成骨成脂的诱导分化吗？这个诱导实验是不是必要的鉴定步骤？

liluli0715

前两个问题我没法回答，我们实验室用脐带和胎盘提取间充质干细胞的，但可以回答第三个问题，间充质干细胞鉴定必须做成骨成脂分化，此外还要用流式做细胞表面抗原。

zuol1505

分离胫骨和股骨的时候，关键是保护好关节面，在分离过程中不要损伤它，力度要适中；可用70%酒精的tissue拭去肌肉，残留少量的肌肉不会对细胞的提取造成很大影响。每只动物取下的骨标本可以先放到灭菌的PBS中浸泡，等都收集完成后，再一起放入hood中进行细胞的提取过程，整个过程尽量要做到无菌。我个人认为提取过程1小时左右还是可以接受的，但是尽量要快。

amney1

. X) m9 W& b( Z1 G8 T' j
" g& Q* T" h- g9 m/ W; p感谢楼上两位的热心解答。
" P! Q6 R  ]  r# @" a6 W* Y; q小弟还有一些疑问：
1 N6 A0 @# C( l8 \$ e) j4 E1 P4 b+ N1.我取出的骨头上有红色血丝渗出，貌似已经破坏到关节面了。是否应该先保留关节软骨，在通风橱提取细胞时才刮掉？
( \8 u1 }, J" _8 h9 V4 @. r2.液体灭菌都是用滤器吗？
0 \8 T6 w7 I. C& f( Z3.用的是全骨髓法，收集到的骨髓有的絮状，有的含较大的团块，是把这些全部直接接种在培养瓶中吗？还是需要先用吹打之类的方法分散细胞？

天山飞鹤

1.尽量去除肌肉，但允许有极少量，也试试无菌刀片刮，可能会快点/ \) Y' r$ l; U5 m+ Z" X
2.尽量在1小时之内，多冲几次，把骨髓腔冲干净2 K* N8 p6 _: _8 M* c  F
3.要做诱导分化，而且还要经流式鉴定，本来就没非常特异性的标记，再不鉴定都不知道是什么细胞了9 d: t2 z$ v! D
另外整个操作过程需无菌，最好跟外科手术的无菌要求一样，冲骨髓得到的细胞可以经滤布过滤去除杂质，第一次换液可考虑在24h时