RNA提取遇难题

sallyshaomy

各位大侠，在RNA提取过程中，异丙醇沉淀离心后，我获得大量RNA，但是在75%酒精洗涤后，再离心发现RNA诡异地消失了，本以为是离心的问题，但是我继续加大转速延长离心时间，依旧没有发现RNA，请问这是什么原因？期待大家的恢复，谢谢！

holywater

trizol还是invitrogen的好

mansnoopy

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十有八九是试剂的问题。重新换一套试剂吧。RNA抽提很简单的

sallyshaomy

谢谢大家哈，我已弄清原因！

redmaple

量太少，加异丙醇混匀后，应该能看到沉淀因为你这里除了RNA，还有DNA，一般量很大。

yyshpy

应该是你自己的问题，要确定异丙醇沉淀后，没有把RNA倒掉，要确定75%乙醇是用DEPC水配制 的，这样肯定不会有问题的

goodboy

我最近一次提取液也出现这种情况，因为样本是别人已经用Trizol处理过的，因此我拿回来之后从氯仿这一步开始做的，12000g4度离心15分钟后没有看到中间蛋白层，我估计是细胞太少或者只是Trizol.

meridian

RNA提取时，所有试剂都需要RNA free处理（DEPC处理或者添加RNA酶抑制剂）。9 _6 u+ T+ j5 r) P& u% @
还有容易造成RNA酶污染的主要原因是手上的油脂，往往是RNA提取初学者产量低的主要原因。
3 g# b3 k7 e; }  g根据你的描述，异丙醇沉淀后，75%酒精洗涤时，如果产量很大的时候，基本肉眼可见。很有可能是你倒掉了0 f' c! r- M. G5 N- ?) i5 U
如果产量还是很少，可以考虑加长沉淀时间，当核酸浓度很低的时候，应该在低温（-20℃）用较长的时间（3-4h或者过夜）沉淀。当核酸浓度较高时，应该室温孵化沉淀效果较好。
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huangcong1988

回复 sallyshaomy 的帖子2 j8 u3 {) ]/ p: C

4 U: h! b3 A! T* f# F# W首先，用TRIZOL提RNA，几乎所有试剂都是需要用DEPC水配制的，另外，有些试剂需要预冷。
1 x5 H( H5 a- G/ I  A( x5 C在异丙醇离心后有沉淀，不能说那就是RNA，因为在异丙醇沉淀后有一步：你要将该沉淀静置至沉淀呈半透明状，那个才可能是真正的RNA。
. W, d- Q/ C* N  }) \3 i所以并不一定很多，洗涤以后没看见沉淀可能是RNA不多，但是你弃上清后加一定量的DEPC水溶解测浓度或者跑胶，你可能有意想不到的结果
) D* T& U. y0 M- ^. Y6 F0 I还有，异丙醇沉淀后建议你最好不要用倒的，用枪头吸最好，吸出上清比较保险，不然容易将沉淀倒出也不一定
$ D. e7 R% z% s: D; q1 o0 S最后一点，75%的酒精是体积比么？如果是质量比最好是70%，不然有可能是酒精的问题% u: |+ U! `2 I& E6 `$ w$ I
祝实验顺利！+ ^! ]4 F. ]- a* U# t% p6 u

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mayansen1314

也许你不该相信你自己的眼睛，你用异丙醇沉淀的时候看到大量的大块东西也许根本就不是RNA，较纯的RNA应该是透明胶状，量不会太多，你用DEPC水配好的75%乙醇沉淀完了之后继续加DEPC水溶解，然后去测浓度及纯度，最后的浓度和纯度才能说明你提取的RNA质量如何