关于 使用流式细胞仪分选人类女性生殖干细胞

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2 I/ i# P% E* R- \) G, g0 ?6 Q      最近看了一篇文献，是关于雌性生殖干细胞分离的文章，然后我自己对这篇文章里的流式细胞仪图片还不太懂，在篇末向大家请教一下，还请不吝赐教。' Y, q7 ^# {) I, y0 L* z# p% e
    这篇文章的作者Jonathan L Tilly教授2004年在Nature上发表了一篇足以颠覆繁殖学基础的文章：通过一系列实验初步验证后，提出在雌性成年小鼠的卵巢中存在一种具有有丝分裂活性的细胞，这种细胞可以在成年小鼠卵巢中通过有丝分裂对丢失的卵细胞进行补充。虽然这一结果遭到了很多人的质疑，但是，2009年上海交大吴际团队的发现进一步证实了这一结果：吴际教授的团队利用免疫磁珠分选技术，利用一个生殖细胞特异性的抗原 MvH ，从成年雌性小鼠的卵巢中筛选出了能够在体外稳定传代6个月（至发稿时）的雌性生殖干细胞，并且在移植到事先用白消安及环磷酰胺处理过的雌性受体卵巢后能生成正常的卵细胞，并且能够产生正常后代（这一结果发表在natur cell biology）。经过三年时间后，Jonathan L Tilly教授于2012年在nature medicine上刊出文章：他们利用流式细胞仪细胞分选技术从育龄期人类女性卵巢中分选出了人类的雌性生殖干细胞，这种细胞已经在体外稳定传代了18个月（至发稿时），并且经过异体移植实验表明这种雌性生殖细胞可以在卵巢皮质部经过有丝分裂产生卵母细胞。这一结果确实具有巨大的突破性意义，但是显然，结果中还有一些不如意的地方，比如：无论是从小鼠中分离到的还是从人类女性卵巢中分离到的所谓的雌性生殖干细胞，在体外培养过程中总是会自发的分化并产生类似于卵细胞的卵圆形细胞，而且经过一系列验证，发现其特性跟卵细胞基本一样。这个结果至少表明：雌性干细胞的体外培养体系仍然需要改进。但是，这无法掩盖这一巨大发现的光芒。下面是Jonathan L Tilly教授在实验中使用流式细胞仪分离小鼠雌性生殖干细胞的其中一个实验步骤（这里用小鼠是因为在这篇文章中，先用小鼠验证了用流式细胞仪可以分选出FGSCs，而我不懂的地方就在这里。但是用于分选人类雌性生殖细胞的技术跟这个步骤一样）。
4 C; ^  h. ], b/ R: a, J+ _! }     作者在分选中所标记的雌性生殖干细胞特定抗原是MvH（Ddx4）蛋白，MvH（Ddx4）蛋白在生殖细胞中特异表达且是一种胞质内蛋白，但是这个蛋白的位置会随着雌性生殖细胞的成熟过程呈现不同的定位位置：在雌性生殖干细胞的时候，其COOH基端会形成跨膜结构域从而可以在雌性生殖干细胞的膜表面呈现，而随着卵细胞的成熟，其蛋白的COOH基端会进入胞质。
' v  P6 V, H- J* X    因为作者Jonathan L Tilly教授在实验前对MvH蛋白的COOH端是否在细胞膜表达仍然心存疑虑，所以他根据生物信息学预测后，对MvH基因表达蛋白的COOH端和NH2端分别设计了抗体：针对COOH端的是兔的多抗（下面就称为COOH端抗体），针对NH2端的是羊的多抗（下面就称为NH2端抗体）。首先对COOH端是否在雌性生殖干细胞的膜表面表达进行了初步验证。
6 y) ]! m9 _" j1 {' K" p: C! w   将雌性小鼠的卵巢制成单细胞悬液后，利用1%无脂肪酸的BSA和1%的普通羊血清（接下来用COOH端抗体反应）或者1%的普通驴血清（接下来用NH2端抗体反应）封闭，之后细胞与一抗反应（COOH端抗体或者NH2端抗体）。清洗细胞后再与二抗反应：用APC标记的羊抗兔IgG或者用Alexa Fluor 488标记的驴抗羊IgG，清洗。利用BD Biosciences FACSAria II cytometer 分选细胞，gated against negative(unstained and no primary antibody）controls。
( S! J- N5 P* V3 \# N    而在下面的图片中显示的实验，第一张是只添加了COOH端抗体后，没有通透过的活细胞直接分选。第二张是只添加NH2端抗体，没有通透过的活细胞用于分选。第三张是只添加NH2端抗体，经过通透的细胞用于分选。下面是图片。* d0 `; @0 o8 T. _* @' h3 F. s
   
3 l0 f' w& ]1 S: ~, i3 t8 U   图片原文说明： FACS plots from the analysis of live or permeabilized cells from dispersed mouse ovaries using antibodies against the N or C terminus of Ddx4. Viable Ddx4-positive cells were only detected with the COOH antibody (red dashed box,reacted with anti-rabbit-APC), whereas permeabilization enabled the isolation of Ddx4-positive cells8 ?% P6 T+ p  |8 ?5 H1 C6 s
using the NH2 antibody (blue dashed box, reacted with anti-goat-488).
( P: c# L" Q3 F- H: g3 I     这个里面我有以下问题（原谅我吧，我是个流式细胞仪的白痴，虽然看了相关资料，可是我还是不懂！）5 D, T0 E/ _: R9 V0 ?$ Q
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   我最看不懂的是图1 c中：8 C( ~, a6 b. _3 h/ I5 I
1.为什么NEG只划那么一小片，为什么不圈住所有那片细胞？NEG外的不都是阳性细胞么，那按文中所画的，还有一大部分阳性细胞不是Ddx4阳性的细胞啊！# F, [" R) f2 E3 S1 ~% @
2.为什么Ddx4阳性的细胞在只添加COOH端抗体后，在Anti-rabbit-APC轴上没有体现（Ddx4阳性细胞在水平方向都和NEG水平，或者还低！），反而在Anti-goat-488 轴上体现(水平右移出来）出来了？
. X3 s( O& l) j. M3.为什么在图1 c 的第二张图，就是中间那张图上，细胞没有通透的时候且只添加了NH2端的一抗，这个时候很明显应该是两个二抗都不可能结合上的（因为要通透后NH2端抗体才能进入细胞），为什么图中还有细胞存在？不应该没有细胞么 ？
; |7 i6 `" P( ^% ?9 P- V/ F. |# |4.这个图显示的纵轴是Anti-rabbit-APC，横轴是Anti-goat-488，那这个意思是用于分离的细胞同时与两个二抗都孵育了，但是只是在一抗上的区别（添加或者没添加）？
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      拜托！！！！！！各位朋友，懂的给我解答下上面的问题吧！！另外，如果看不懂我上面罗嗦且纠结的叙述，我奉上原文，大家可以看下，然后来回答我的问题！我跪求解答啊！！！！
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         下面是补充材料：
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chenchunlei

我这周就讲这篇文章，对于这个抗体分选的OSCs图也看不懂，本人觉得figure1中的C图COOH分选的阳性细胞应该在阴性细胞的左上方

leisong12

"那个Anti-rabit-APC  是用来排除自发荧光的，不知道改如何理解"       这个也有可能，我没有调查过该细胞自发荧光光谱范围，但是可以单看APC标记，发射波长660nm, 个人认为动物细胞自发荧光不会达到该值，所以用APC标记的抗体检测不会与自发荧光重叠。Alexa Fluor488发射波长519，PE是575，很可能与细胞自发荧光发生重叠。但是实验都是会设置对照的，应该没有这个问题啊，真不知道作者想说什么？

cneagle66

4 z0 P" w, _+ B" [- @- q& U, z3 z. C' C3 `4 r
对于这3张图，发表些自己的看法。
2 X& |6 I( ?8 \' f* n' R对于活细胞，从染色看，第一张只加COOH端抗体-APC，所以按照文字，应该是细胞在APC纵轴上移，（而后作者说是印刷错了，真的么？）中间张图，只加NH2端抗体，488几乎无细胞染色，所以从前两张图上看，应该是COOH端可以在胞膜上检测出来，而用NH2端抗体检测不到阳性细胞。所以，我觉得作者给你回信说是印刷错误，也不好解释这两张图。
) Q! m6 i% \- G: G+ W* y第三张纯粹是穿孔染色的对照。8 k; O3 @+ u5 }+ R1 l
他用这两个颜色染色，就用他们做纵横轴，我觉得没有什么问题。
" _- C2 S$ m/ u6 t阴性区域为什么那么小，我想应该是用无染色的对照划定的区域，不影响结果判断。7 [  T4 a! w) z) H0 t; H" \& M
) ^3 }) C. E/ Z; U  p
结论，图的确有问题，怎么解释只有作者知道，暂时相信他的结论吧，自己重复实验以后才知道。# N% ^0 j9 Q7 u2 ^0 J& u4 q: Y0 i4 J

/ q9 i. c. K6 j- x# S+ S另外，若有新的发现，还请来这里告诉大家一声，一起进步啊！

a2782953

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& ]/ R8 l' t/ ?/ H回复 leisong12 的帖子! [* m3 c# l* v9 e& {# D4 S

: L9 C- ~) w2 M0 [/ L     对啊。。。我同样纠结于此啊！！！！我还在想我是不是关于流式的知识太少了，所以理解不了，问了好几个同学，都搞不清楚这是怎么回事。握个手先！至少知道不是我一个人被作者弄晕了。。呵呵   谢谢这位朋友了！ 不过作者说图中 那个Anti-rabit-APC  是用来排除自发荧光的，不知道改如何理解。。

leisong12

什么印刷错误，根本是作者自己没搞清楚。第一个图不互换坐标也行，但是出现在右边的那群细胞应该出现在左边细胞的上边才对。该图是错的3 k* h, i6 Y) h$ C1 P" u- B

leisong12

补充：可能没说清楚，即第一个图的横坐标和纵坐标应该互换就对了。

leisong12

检测COOH端用的是抗兔二抗（APC标记），所以第一个图横坐标标错了，应该是Anti－rabbit-APC, 由于该图没有同型对照或阴性对照，所以分选门的设置过程我们看不到，从图上看这样设阴性和阳性门问题也不大。 不可能用了分别两种抗羊和抗兔的488标记二抗，因为检测的cooh是兔抗（二抗联APC），NH2是羊抗（二抗联488），如果第一个图横坐标换为anti-rabbit488,那么横坐标和纵坐标测的是同一个东东，即都是COOH，那样是错的也没有必要。

a2782953

经过与本文作者的沟通，发现引起我产生歧义的一个地方是印刷错误： FACS plots from the analysis of live or permeabilized cells from dispersed mouse ovaries using antibodies against the N or C terminus of Ddx4. Viable Ddx4-positive cells were only detected with the COOH antibody (red dashed box,reacted with anti-rabbit-APC)，也就是这里，应该是 anti-rabbit-488.另外是：作者标记在纵轴上的 anti-rabbit-APC 是用来排除自发荧光的。 基本上我现在的问题就能解决了。但是仍然有最后一个疑问：为什么作者把横轴设置为 anti-gout-488.因为作者在补充材料 ，并且也在邮件中确认，这里用到的就是两个抗体  anti-rabbit-488和 anti-gout-488.可是横轴为什么指标及 anti-gout-488？  望了解的朋友来解答下！

a2782953

回复 evial 的帖子
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哦哦，呵呵，这个倒是看出来了，谢谢啊！主要是那个 纵轴和横轴问题，我搞不懂。。流式细胞仪的图中有这么标记纵轴横轴的么？