求教成纤维细胞转染

idealgas

不才在做脂质体包装质粒转染成纤维细胞，用的是lipofectamine LTX，不知道有没有同路中人在做这方面的工作。遇到一些问题，想问问各位业内人士。
4 V# J; _4 G7 j9 A  v6 W6 c3 X7 E1 脂质体转染成纤维细胞中，通常的转染效率能达到多高？不同细胞对脂质体耐受程度和吸收程度不同，不知道各位都在什么细胞上面做过转染，能达到多高的水平？9 [& ^1 X# Q$ ]2 g$ y. ^: Z: n
2 与电击转染相比，哪一种方法效率更高些？6 w0 H( k' A: o/ |8 Q
3 多个质粒同时包装转染时，都会有哪些因素影响到转染效率？1 L: k0 X& S5 L' m; y
暂且就这几个问题需要大家的帮助，恳请各位先驱者不吝赐教！谢谢！谢谢！0 @# {. ]) B  u# a0 M+ G

modou1001

我们转染的好几个物种的成纤维， 还转染精原干细胞，转染效率跟基因是 有关的。 这么说吧， 我们转染空载体的效率很高的，用的脂质体跟你们用的一样， 转染率成纤维达到80%以上，精原干细胞也差不多。 个人觉得电转染对细胞的伤害大点。

jefferson

idealgas 发表于 2012-3-28 22:54
* b' Z) ]( p( |* n* C) U不才在做脂质体包装质粒转染成纤维细胞，用的是lipofectamine LTX，不知道有没有同路中人在做这方面的工作。 ...

9 k" W2 a7 J0 h5 H" e8 Z
1. LTX是LIPO2000的改进型产品，效率算是比较高的。成纤维细胞没转过，转过肿瘤细胞。按照说明首先进行转染条件摸索后，最高效率可达到90％以上。建议你先按照Protocol进行预试验，将最佳的混合比例做出来，即效率很高，同时毒性较小，然后再进行实验。! R2 D3 q, H. W3 l6 D3 H6 x2 ^

* T. G1 R1 S+ B) b9 |4 N2. 转染效率的高低，跟转染方法有关，也跟转染的细胞，质粒的大小等因素有关。一般转原代细胞，或者干细胞等，或者你的质粒比较大，电转效率会比较高。但如2楼所说，电转对细胞伤害较大，细胞会死的比较多。
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) H  R# B6 a; _- P8 j3. 多质粒共转和转一个质粒，对转染方法本身来说，差别不大。脂质体或电转不会去选择转哪个质粒不转哪个质粒。共转的效率主要受几个因素影响，第一，质粒大小。如果几个质粒的大小差别较大，那效率将有一定差别，小的质粒更容易转染进去；第二，质粒的量。一般共转的话，质粒的量较大，如果用脂质体，量也要相应增大，细胞毒性是需要考虑的，其次在一定量细胞数基础上，一次最多能转的量，也是需要摸索的。比如你10000个细胞，转20ug和10ug的质粒，能转入的质粒量应该是差不多的。

ying

回复 modou1001 的帖子( z! w: A( w# L4 x

7 n  |! p0 F$ r. P1 H请教您一下，精原干细胞您是用什么promoter?我试过EF1a，好像不表达。

modou1001

回复 ying 的帖子# G) B+ z9 j9 E! x7 F8 ^8 H; l2 x

( h8 B# U1 m. W6 ~0 `( ]& hCMV的
, B% K1 W5 Z' n8 j  ^* H3 b! [

ying

回复 modou1001 的帖子0 _2 W+ s  q9 q6 h

2 h, J# r% F6 ]* B( h" H% j0 X哇～好厉害！因为我看书上说CMV在ES里面不表达，所以我在SSC里都不敢用CMV。

idealgas

回复 modou1001 的帖子; l$ ~! N. o3 H- S8 V" ~

! M2 m; _  r$ M. _" V0 V9 p4 g2 [居然能够达到80%以上！！！！实在是太厉害了！我做的转染基本上都在10%左右徘徊，再高也高不了了，不清楚什么原因。也按照说明试了条件了，可是还是上不去，后面的工作效率也就跟着下降，都快头疼死了！: o: }! V, v2 e" k4 t& S! v. t

modou1001

回复 idealgas 的帖子# L  O# H8 }5 h5 S# `. k: u

- Z5 i" O) Q2 p+ D0 j3 U% _) _2 A, P影响转染率的因素有很多，质粒大小、细胞状态、转染方式等等，但是就基因本身的影响也很大，多做几次可能效果会好点，祝实验顺利

miRNA

poor idealgas........9 c& l! K9 p! d. ]
2011-4-13 14:41 [请教] 电转染牛成纤维细胞的问题
$ Z/ T2 E* e' U$ k0 X) ?: Z' V" N2012-3-28 22:54 [请教] 求教成纤维细胞转染 这次换用LTX了...

miRNA

回复 modou1001 的帖子
4 U8 k6 s) M! O- o7 K+ N8 ]9 Q# M3 O. E; A. p3 ?: N
您能将具体的实验步骤说一下吗？4 h- ?( V) n1 A& Q
比如说，质粒大小是多少？质粒是手提的，一般试剂盒提的，还是qiagen提的？! h/ R+ K$ z( X+ j3 P+ q! X
一次转染，还是二次转染？如果是二次转染，具体步骤能说一下吗？
& e! |& p; {7 k# [转染时细胞密度是多少？所用的转染试剂是？
9 C0 I1 G8 o- S$ W1 n+ k转染方法是根据转染试剂的说明书来的，还是稍微有改动？
  Z  e$ s+ y5 L, i& h+ s+ n4 n6 ?
神啊，救救我们吧..........
! n3 E0 o" I+ S8 |2 w% a哈利路亚......