关于慢病毒转染的几个问题咨询

wangwang1987

1. 刚刚在addgene买了几个plasimd. 但是又四个是以Tet-o 开头，有四个是以Ptight 开头.想知道有什么区别么.5 Q. d. n  [5 X
2. 各位有用psPAX2和VSVg 包装的protocol么？因为刚刚开始没什么头绪的感觉，不知道具体用量.; S/ E& [+ ?! P5 A  l

telomerase

我们用的是pMD2G的那个，过程差不多
6 H! [! \! L% R和包装逆转录的过程一样，我们用的是lipo，方法请参照lipo用法
* M6 ^+ d  C# t  H$ d, `9 M, K  T* D9 g5 A. ~
要注意的是：
$ U- w/ D  I5 ^2 p, U质粒的比例比较重要; N. k* q( P( I" |3 i# H* U$ y, m
细胞的状态比较重要
6 I& f! I6 A# o* V  z# o5 H- G包完浓缩下，超离或浓缩柱
( P0 s5 Q2 {+ W' M( @! O  X. l( F. ?感染时必需要加polybrene，离心效果更佳

wangwang1987

回复 telomerase 的帖子" [$ t5 Y0 Y3 n' X5 K; N1 `( z8 G, D
% r, l$ C) n' j" i
谢谢~还有一个问题就是2X HBS的PH的问题。因为不知道多少合适，我想验证那一个PH下可以滴度 更高。结果博后说太麻烦，让我直接做。现在只做了一个2X HBS加入细胞后第二天的液体的PH变化。我觉得这样很不准确的感觉~~但是也不知道怎么去反驳~~

telomerase

2X HBS
6 g+ G/ r; ]) Z. S% G1 Q1 b& O# z! x+ d6 N- |
280 mM NaCl-----8.18g / 500 mL
4 n; I5 o- a8 ?
0 l* J2 o* I  f! k# a7 L10 mM KCl-----.18g/ 500 mL
7 F/ `' V! v# |" Q1 r% p1 O6 G; t' B9 u
1.5 mM Na2HPO4 * 2H2O-----.2g of Na2HPO4 / 500 mL- ~/ z% P7 A: g

4 f) Z) M; H9 x$ a12 mM Dextrose-----1.08g / 500 mL  7 H$ N* v( \. E* ]0 X" M8 K$ \
0 k  B: p! K* G8 V- h
50 mM HEPES----5.96g/ 500 mL
, f2 A5 n# H  _+ C
) \! t- t: m5 O% ECarefully pH to 7.05 and raise to 500 mL volume. Aliquot and freeze. 9 k9 ?4 U' `- E6 d* ^: }
是这个吗？没用过。。。。。。。。, h% v8 r# z; ?4 E: d6 \
但看配方PH是一定啊！！！/ q9 I0 A/ ?2 ]+ C2 e, Y0 j

daviddow

直接用lipo算了

daviddow

直接用lipo算了

huangcong1988

回复 telomerase 的帖子& G, v7 y: L1 F) Z# r' q- ]

% e& a' f" a2 I$ {$ A我直接是收集的慢病毒里面加PEG8000（终浓度为10%），然后混匀后静置过夜，然后6000~8000离心半个小时，然后就得到沉淀，这样行吗？我看他们有的加蔗糖，不知道我加PEG8000有影响么？

huangcong1988

回复 wangwang1987 的帖子9 i  K  U& [- W$ M! Z# ]) N
6 z2 M7 m/ G% O% E3 G' n5 m0 k
现在包毒基本就是 FuGENE HD和lip2000，个人用的是lip2000，觉得效果还行，转染过程跟普通质粒转染差不多，要注意的也就是telomerase说的那些

wangwang1987

回复 huangcong1988 的帖子
# {" d% X  }) d6 g6 D2 O! ]! s- a8 n* j) ^: S/ g3 I
谢谢~~

xxh83121

大家的慢病毒载体都是从哪里买的？是已经包装好基因的还是空载？新手，望大家支持