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给你发个步骤参考一下:)
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1.MEF的获取：（步骤4－12已经进行实践）$ s0 L& E t6 D9 t$ P
（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵
2 _3 B0 ^+ M' X$ v（2）2：1合笼过夜(雌：雄)*
3 p, I' Y# \0 f（3）取出有阴道栓（即乳白色或淡黄色冻胶状物，确定其已经怀孕）的开始记时间为0.5天 2 o5 X/ W p. v' m/ B d
（4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料( Y, @( F/ U+ B9 ?) t- L* D; a* v6 h4 T1 I
（5）颈椎脱臼法处死孕小鼠，放于盛有75%酒精的烧杯中消毒，拿到超净工作台上解剖，先剖开腹部皮肤，暴露子宫，然后换另外一套手术器械，用眼科镊提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角，取出子宫，置于装有PBS的培养皿中。4 w% K) x! K) ^# v2 g3 [' U
（6）取出胎鼠，在PBS中洗涤数次。去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部。在PBS中充分漂洗，弃除红细胞。(用两个镊子配合即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)（若是想培养神经干细胞，则用剪刀剪取前脑进行培养即可）（可以一起处理多个胚胎）
) i7 U" A1 K7 q' T3 o e9 q （7）在新的培养皿中加入少量PBS，放入躯干部分，用眼科剪刀剪成1mm3以下的组织块碎片（可以剪的更碎一点，下步的消化时间就可以缩短）。. T. P& e, s5 o% `0 b3 L# b z. p$ i3 {: `' Y! z& X( I
（8）加入2~4ml 0.25%胰蛋白酶，培养箱中消化10—15min，消化结束后加入等体积（多加点也行，只要不是少加，保证彻底的终止消化反应）的MEF Medium终止消化反应，轻轻吹打，使细胞分散。（做原代消化的时间稍长，胰酶用量也大，若是做传代，则只需加入500微升，最多1ml的胰酶，消化1~3min。）（躯干组织不易消化，做原代和传代时，故都用0.25%胰蛋白酶；而脑组织较易消化（脑肿瘤组织），原代和传代都用0.05%胰蛋白酶。）（消化可能不完全，也可室温静置5－10min，弃组织块，这样下面过滤就相对容易。）（如果消化得到的细胞太少，可以离心弃上清，PBS洗涤，重新加胰酶消化）（胰蛋白酶，Trypsin ,最适条件pH8.0，37度，溶液中钙镁离子和血清会降低其活力，故消化用的胰蛋白酶中加入了EDTA。消化结束时加入含血清的培养基即可终止反应）
' G. d+ s1 M! b1 F% N: h3 N （ 9）将收集的细胞悬液离心，1500rpm， 4min，弃上清，加入红细胞裂解液（3~5倍体积的细胞体积），轻轻吹打1min，离心除上清，若仍有红细胞残留，则须继续进行红细胞裂解步骤。 i6 F- J, J3 b, y. [+ E- k7 `
/ t! o- m+ f6 A# G8 q S2 [4 Y0 r* m（10）离心，弃上清，重悬细胞，过滤（200目筛网）并收集滤液，离心除去上清。$ x. J' Z5 v s
# ]7 H. G7 @3 o（11）用MEF Medium洗涤沉淀，离心除上清，重悬细胞，铺板即可。置于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。（一只老鼠会有多个胚胎，得到的单细胞，可铺到三个培养皿中或者更多的培养皿中进行培养）9 P. ^* m; x, K) m" B# A4 a% t: t& T" {
（12）第二天换液，随后每2天换液一次。培养2～4d后，MEF接近汇合，即可按1:3比例传代培养。6 s5 ~* C' H/ n" r) v/ F; A5 N' ]9 ~: }
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要点: 无菌是操作关键, 动物皮毛不能直接或间接接触到子宫, 分离子宫时必须换用另一套无菌的眼科剪和眼科镊。培养同一株胚胎干细胞最好延用相同品系小鼠来源的成纤维细胞。9 l( a. }; _! p
, U# U2 R$ j! U6 A! C2 a& A. r要点: 仔细观察原代细胞有无被杂菌污染的迹象, 并且检测支原体, 确定无污染后传代扩增。
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发表于 2012-5-13 18:21
