求教关于提取小鼠BMSC的几个问题

bty007

1 用DMEM培养液冲洗骨髓的方法冲出股骨胫骨骨髓，培养液里必须加肝素吗？好多文献里没提到肝素，不加可以吗？骨髓凝的话还能提出干细胞吗？
3 Q6 Z/ ^. h) K' g5 A# i2 冲出骨髓液后是直接离心？还是先用200目筛孔过滤后再离心？还是用注射器不同孔径针头抽吸几次制单细胞悬液再离心？看到好多人用了很多不同方法，不知道哪个好？
) H( Q# A" p4 b  _+ d* h- [" G3 查到有种骨片培养法，骨头剪碎成小骨片，加胶原酶振荡消化，是用I型还是Ⅱ型胶原酶？有什么不同吗？
- \/ U$ D' |+ H2 `4 胶原酶消化后可以直接弃上清？还是先加点缓冲液离心一下？  _# M0 i1 U+ O1 b
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请前辈们给些指点，非常感谢

金戈

( R- E! J5 c$ l$ o; B- a
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2 [: g3 i$ a4 ~( A1 U1. 可以加少量肝素抗凝，但肝素多了影响贴壁。不加肝素是可以的，没有影响。% n6 P/ u- q) n
2.冲出骨髓液以后的方法，犹如八仙过海，各显神通，影响不大的。有人用全骨髓，也有人用FICOLL分离等等。$ C; B" d2 a! B. f7 j- U. W
3. 骨片培养法，这里有份详细的PROTOCOL，见附件。# r) G! n: I/ A- _: i( J5 @6 e3 ^8 c; p

wuyannini

1、不用加肝素，没有影响。骨髓不会凝
/ p$ f' I7 F# c+ ~2、冲出骨髓后，可以用70um细胞滤网过滤后再离心直接培养。也可以先把骨髓尽量吹打开之后，再用10ml注射器吸取骨髓，之后换最小孔径的针   8 @+ e' W. W+ k$ E0 b% {+ t
   头过滤骨髓，制成单细胞悬液再进行培养。这两种方法是用滤网过滤比较快，第二种比较慢。但效果都不错，我都试过。
2 Z2 E( q, g/ h  i+ S3、至于骨片培养法，没有做过，所以提供不了有价值的东西了呵呵

无言浪紫

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sdsgliufeng1

顺便问一下各位前辈，什么时候第一次换液，是半换还是全换，提高细胞密度以及增加血清浓度对加速培养影响如何

细胞海洋

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wuyannini

3 d9 P. y( M4 i# U# ^" X; b  c1 g% _' K: u5 f1 E+ S
回复 sdsgliufeng1 的帖子. c. U! I* Q) k9 l! Q

" t/ E0 W  k& B$ F9 d; t1、我都是全换的，一般是72小时第一次换液，之后是48小时换液。  P7 W3 F% [8 U+ y8 [
2、刚提出来的细胞，一般就是用corning的60mm的培养皿，一只小鼠接种一个培养皿，密度太低细胞不利于生长。
/ G; u5 l  ^9 b3、血清用的就是10%的FBS，增加到20%我感觉也没好到哪里去，差不多。

BLUESELLY

骨片法的话，用1型胶原酶（我一般都有sigma的），不能弃上清，因为消化出来的细胞都在液体里面，收集这些液体，离心后再接种。2 D$ i" k+ I( y9 H4 V2 V
可以反复的消化，我每次都是消化3次，然后收集。最后消化完的骨片，也可以加培养液在6孔板里面养。

fancheng167

也在养msc

把栏杆拍断

我也在养