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脐血来源的单个核细胞诱导CIK,细胞增殖缓慢,什么原因呢?   [复制链接]

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楼主
发表于 2012-5-25 13:17 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
脐血来源的单个核细胞诱导CIK,细胞增殖缓慢,什么原因呢?用淋巴细胞分离液分离单个核细胞时,没有出现明显的淋巴细胞层,而是与分离液混在一起,分离液对细胞有损伤吗?
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沙发
发表于 2012-5-25 19:48 |只看该作者
你说“用淋巴细胞分离液分离单个核细胞时,没有出现明显的淋巴细胞层,而是与分离液混在一起”,现在的问题是你分离的是不是淋巴细胞。
  ]4 e. N: k5 K2 y我们的分离方法:
% u; ^' A9 k; M将25 ml稀释的血标本(全血去血浆后与盐水1:2混合)缓慢加入盛有室温的15 ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中。离心(参数相当重要),慢升慢降。离心完毕后,离心管内出现明显的分层,由下到上分别为:红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。吸取血浆层弃之,直至距白膜层5毫米(mm)处。将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。; H; X  c- q" {% t; h, r
; Z. y& }# C2 q, Y" l
诱导CIK,细胞增殖缓慢,培养基的类型,添加的因子量很关键。不知你是怎么做的?
7 n% h5 m9 S4 f: B* @/ p4 p5 O: j3 c1 b/ W. ^+ I
我们做脐血诱导的CIK细胞增值效果是非常强的,比成人外周血效果好得多。
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藤椅
发表于 2012-5-26 08:43 |只看该作者
感谢大少爷的回复。' T9 L  W+ }4 N. }2 j
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1:1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中,不是室温的淋巴细胞分离液,是放置在4℃冰箱的。离心力是800g,是不是离心力太大了。离心完毕后,离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层,由下到上分别为:红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之,将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞,但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快?培养基用的Takara的GT-T551培养基,细胞因子CD3抗体,Takara的RetroNectin,IFN-γ为1000U/ml,IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换,IL-2是否要补齐?可否告知你怎么添加的细胞因子量?谢谢!6 U0 A8 ]) A7 C5 D
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板凳
发表于 2012-5-26 08:43 |只看该作者
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感谢大少爷的回复。) @  A& r2 q, w+ s4 D* h$ J
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1:1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中,不是室温的淋巴细胞分离液,是放置在4℃冰箱的。离心力是800g,是不是离心力太大了。离心完毕后,离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层,由下到上分别为:红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之,将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞,但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快?培养基用的Takara的GT-T551培养基,细胞因子CD3抗体,Takara的RetroNectin,IFN-γ为1000U/ml,IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换,IL-2是否要补齐?可否告知你怎么添加的细胞因子量?谢谢!, R" f/ X* u9 f1 e7 P) L

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报纸
发表于 2012-5-26 08:43 |只看该作者
感谢大少爷的回复。$ Q& P% ^2 W: X  c$ q# _5 B$ P
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1:1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中,不是室温的淋巴细胞分离液,是放置在4℃冰箱的。离心力是800g,是不是离心力太大了。离心完毕后,离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层,由下到上分别为:红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之,将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞,但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快?培养基用的Takara的GT-T551培养基,细胞因子CD3抗体,Takara的RetroNectin,IFN-γ为1000U/ml,IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换,IL-2是否要补齐?可否告知你怎么添加的细胞因子量?谢谢!
, K6 ^+ ^) l: z+ V& p

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地板
发表于 2012-5-28 08:58 |只看该作者
回复 大少爷 的帖子
8 N* j' E) ]" b* D+ U& X% r  N# l7 L. b/ F6 O" b- S
感谢大少爷的回复。, D) S' d. Z) y# p% P8 t
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1:1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中,不是室温的淋巴细胞分离液,是放置在4℃冰箱的。离心力是800g,是不是离心力太大了。离心完毕后,离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层,由下到上分别为:红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之,将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞,但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快?培养基用的Takara的GT-T551培养基,细胞因子CD3抗体,Takara的RetroNectin,IFN-γ为1000U/ml,IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换,IL-2是否要补齐?可否告知你怎么添加的细胞因子量?谢谢!' c/ ^8 V4 a- E7 @% y0 I  r

( j% h3 Q& c  ~. r: U+ _大少爷 看前面

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发表于 2012-5-28 08:59 |只看该作者
回复 mengnancy 的帖子
8 {  i/ @( Z+ m1 [
" ?0 O! u+ v/ K; a6 W- T" ?+ u9 Z你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容 像我这样
1 q' n% D: i4 h2 q否则 他会可能不到你的提问

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发表于 2012-5-28 13:11 |只看该作者
不知你的FICOLL是什么牌子,你可以按照说明书上的离心力和时间来离心。吸的单个核细胞层再加PBS洗涤两次,去掉一些红细胞和血小板等杂质,离心力300g左右。
; a9 i& D. b  W8 A7 Y% p# V% y用Ficoll液分离PBMC,洗涤两次,计数并用培养液调细胞浓度为 2x106/mL,当天加入1000 U/mL的IFN一γ于37℃,5% CO2悬浮培养,24 h后加入50 ng/mL的CD3McAb、100 U/mL的IL一1及1000 U/mL的IL-2,,每隔2~3d换液一次,前期细胞状态不好可以半量换液,状态好的话等量加液。第三次加液前先计数,然后按照1-2x106/mL加培养基。4 g0 q' x# N) c3 q. ]3 ]
CIK一周左右时增值的是最快的。第三天或四天的时候数量会有所下降,第七天左右会急速增加。所以不要着急,先养着看看。
$ U! x+ m0 a* F+ `. l
- ^! I- y- o3 q1 \: |* z, Z前几天换液,如皋状态不好,是吸取一半培养基,离心,换新培养基重悬细胞,按照总培养基量加因子。
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发表于 2012-5-28 13:25 |只看该作者
回复 mengnancy 的帖子- ~3 P; F" u: k$ x3 L
; y" C/ t+ g) i3 [" g2 p: p
请问下,你们用脐带血诱导cik,对血液除了传染病学检查还需要做哪些?

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发表于 2012-5-28 14:37 |只看该作者
回复 hwlightning 的帖子
# _$ B) q1 E4 C( o! p3 h# l: r, Q' t" d# k' r8 V, g1 j
对脐带血只做了传染病学检查,包括乙肝表面抗原、丙肝抗原、梅毒和HIV。因为现在做的是预实验,所以其他的没有做了。
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