脐血来源的单个核细胞诱导CIK，细胞增殖缓慢，什么原因呢？

mengnancy

脐血来源的单个核细胞诱导CIK，细胞增殖缓慢，什么原因呢？用淋巴细胞分离液分离单个核细胞时，没有出现明显的淋巴细胞层，而是与分离液混在一起，分离液对细胞有损伤吗？

大少爷

你说“用淋巴细胞分离液分离单个核细胞时，没有出现明显的淋巴细胞层，而是与分离液混在一起”，现在的问题是你分离的是不是淋巴细胞。
  ]4 e. N: k5 K2 y我们的分离方法：
% u; ^' A9 k; M将25 ml稀释的血标本(全血去血浆后与盐水1：2混合)缓慢加入盛有室温的15 ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中。离心(参数相当重要)，慢升慢降。离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。吸取血浆层弃之，直至距白膜层5毫米(mm)处。将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。; H; X  c- q" {% t; h, r
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诱导CIK，细胞增殖缓慢，培养基的类型，添加的因子量很关键。不知你是怎么做的？
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我们做脐血诱导的CIK细胞增值效果是非常强的，比成人外周血效果好得多。

mengnancy

感谢大少爷的回复。' T9 L  W+ }4 N. }2 j
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！6 U0 A8 ]) A7 C5 D

mengnancy

感谢大少爷的回复。) @  A& r2 q, w+ s4 D* h$ J
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！, R" f/ X* u9 f1 e7 P) L

mengnancy

感谢大少爷的回复。$ Q& P% ^2 W: X  c$ q# _5 B$ P
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！
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细胞海洋

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感谢大少爷的回复。, D) S' d. Z) y# p% P8 t
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！' c/ ^8 V4 a- E7 @% y0 I  r

( j% h3 Q& c  ~. r: U+ _大少爷 看前面

细胞海洋

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8 {  i/ @( Z+ m1 [
" ?0 O! u+ v/ K; a6 W- T" ?+ u9 Z你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容 像我这样
1 q' n% D: i4 h2 q否则 他会可能不到你的提问

大少爷

不知你的FICOLL是什么牌子，你可以按照说明书上的离心力和时间来离心。吸的单个核细胞层再加PBS洗涤两次，去掉一些红细胞和血小板等杂质，离心力300g左右。
; a9 i& D. b  W8 A7 Y% p# V% y用Ficoll液分离PBMC，洗涤两次，计数并用培养液调细胞浓度为 2x106/mL，当天加入1000 U/mL的IFN一γ于37℃，5% CO2悬浮培养，24 h后加入50 ng/mL的CD3McAb、100 U/mL的IL一1及1000 U/mL的IL-2，，每隔2~3d换液一次，前期细胞状态不好可以半量换液，状态好的话等量加液。第三次加液前先计数，然后按照1-2x106/mL加培养基。4 g0 q' x# N) c3 q. ]3 ]
CIK一周左右时增值的是最快的。第三天或四天的时候数量会有所下降，第七天左右会急速增加。所以不要着急，先养着看看。
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- ^! I- y- o3 q1 \: |* z, Z前几天换液，如皋状态不好，是吸取一半培养基，离心，换新培养基重悬细胞，按照总培养基量加因子。

hwlightning

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请问下，你们用脐带血诱导cik，对血液除了传染病学检查还需要做哪些？

mengnancy

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对脐带血只做了传染病学检查，包括乙肝表面抗原、丙肝抗原、梅毒和HIV。因为现在做的是预实验，所以其他的没有做了。