脐血来源的单个核细胞诱导CIK，细胞增殖缓慢，什么原因呢？

mengnancy

脐血来源的单个核细胞诱导CIK，细胞增殖缓慢，什么原因呢？用淋巴细胞分离液分离单个核细胞时，没有出现明显的淋巴细胞层，而是与分离液混在一起，分离液对细胞有损伤吗？

大少爷

你说“用淋巴细胞分离液分离单个核细胞时，没有出现明显的淋巴细胞层，而是与分离液混在一起”，现在的问题是你分离的是不是淋巴细胞。
' ^! Z) I& B7 t$ a% S+ K7 T( E我们的分离方法：( y# e5 x% {4 ?% i  S5 V
将25 ml稀释的血标本(全血去血浆后与盐水1：2混合)缓慢加入盛有室温的15 ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中。离心(参数相当重要)，慢升慢降。离心完毕后，离心管内出现明显的分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。吸取血浆层弃之，直至距白膜层5毫米(mm)处。将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。* @! l1 @7 S& t4 D8 f4 N" g: M

2 C( U6 S: {: [) {诱导CIK，细胞增殖缓慢，培养基的类型，添加的因子量很关键。不知你是怎么做的？
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: g3 q9 \8 J6 I  h我们做脐血诱导的CIK细胞增值效果是非常强的，比成人外周血效果好得多。

mengnancy

感谢大少爷的回复。6 e/ c: M' E# W' Z) g: X/ _8 s
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！
" U3 P. o; r5 s* L

mengnancy

感谢大少爷的回复。
% x$ K7 I8 _+ z$ v6 H2 \! k% J# h3 T我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！! _7 _$ _; A, ~' r* T: A. A

mengnancy

感谢大少爷的回复。
- ]( ^8 E9 S) |9 ?" T5 \" s我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！) Z* w2 O4 ]; }, w7 c$ I, n" R; ]1 I

细胞海洋

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感谢大少爷的回复。& Q5 N6 F. K* b( d; V. ]  N# ?
我们是稀释的血标本(全血去血浆后与PBS按1：1混合)缓慢加入20ml人淋巴细胞分离液的50 ml无菌离心管中，不是室温的淋巴细胞分离液，是放置在4℃冰箱的。离心力是800g，是不是离心力太大了。离心完毕后，离心管内没有出现明显的淋巴细胞层分层，由下到上分别为：红细胞层、粒细胞层、Ficoll层、单个核细胞层和血浆生理盐水层。我也是吸取血浆层弃之，将红细胞层之上的所有液体转移至离心管。分离到的细胞是淋巴细胞，但是就是增殖比较缓慢。CIK第几天增殖的最快？培养基用的Takara的GT-T551培养基，细胞因子CD3抗体，Takara的RetroNectin，IFN-γ为1000U/ml，IL-2为300U/ml。换液是全量换还是半量换，IL-2是否要补齐？可否告知你怎么添加的细胞因子量？谢谢！
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大少爷 看前面

细胞海洋

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) Z4 ^6 t0 K4 g2 ?3 w
1 C2 v9 |* P6 k/ }0 C$ @你回复谁 就点击对方回复帖子中的回复按钮然后输入内容 像我这样
6 [$ @% O! j; E. h8 Q6 E否则 他会可能不到你的提问

大少爷

不知你的FICOLL是什么牌子，你可以按照说明书上的离心力和时间来离心。吸的单个核细胞层再加PBS洗涤两次，去掉一些红细胞和血小板等杂质，离心力300g左右。  p& l' m9 S% V5 W8 u% N
用Ficoll液分离PBMC，洗涤两次，计数并用培养液调细胞浓度为 2x106/mL，当天加入1000 U/mL的IFN一γ于37℃，5% CO2悬浮培养，24 h后加入50 ng/mL的CD3McAb、100 U/mL的IL一1及1000 U/mL的IL-2，，每隔2~3d换液一次，前期细胞状态不好可以半量换液，状态好的话等量加液。第三次加液前先计数，然后按照1-2x106/mL加培养基。
0 k2 g6 z1 H6 DCIK一周左右时增值的是最快的。第三天或四天的时候数量会有所下降，第七天左右会急速增加。所以不要着急，先养着看看。
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前几天换液，如皋状态不好，是吸取一半培养基，离心，换新培养基重悬细胞，按照总培养基量加因子。

hwlightning

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! L3 k; F% W* q: o
5 P3 B3 H# c0 F6 y1 ]请问下，你们用脐带血诱导cik，对血液除了传染病学检查还需要做哪些？

mengnancy

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  \" r$ e$ i4 f# M$ J6 s6 Q5 z" |$ M6 ?, a/ R7 _0 M/ e" y3 `
对脐带血只做了传染病学检查，包括乙肝表面抗原、丙肝抗原、梅毒和HIV。因为现在做的是预实验，所以其他的没有做了。