为什么插入片段后，细菌的培养温度变化了？

miRNA

RT，一般pCDNA3.0载体插入大部分的目的基因后，转化后都是在37°中培养，
5 ?* J0 Y9 |8 k) S) }. F为什么插入有的目的基因后，转化后却需要在25°中培养才能长出来？1 a8 n# D! ?  s: ]7 k+ l

weiyepan

+ l. t1 S- _  ^3 u# B: m
0 {) e) c3 q+ K/ T
回复 miRNA 的帖子
, N+ e; P. ^  t. p5 g0 \" Q' w
4 w6 ^) j- ^- [) E- [# f原核的启动子区很小，一般只有8个碱基左右，如果你的外源基因比较长，那内部启动的可能性也是有的。也有涉及到温度启动的原核转录因子，一旦启动了转录，你的后续编码对细菌有毒性，就会出现长不起来的现象。
- C& h6 H& `; [9 |这种现象的解决办法一般是要把你的基因密码子优化一下，可以提高菌长的效率。

shy8610

回复 miRNA 的帖子2 W  D8 ~, b, V7 o& ^; W

" s2 M1 E2 _- K/ e不好意思说跳过了，转化当然不需要转数，挑克隆增殖的时候，发现温度和转数都得降，哦，有大量高度重复序列，我们那个末端是LTR区，略有不同，但都属于大片段

miRNA

回复 shy8610 的帖子
& T* G. ]1 R; P2 s) o# }: H1 G1 x& m$ B* \% i1 c. W8 [
就是人的基因，3kb，只是最后1kb是高度重复序列...我想问一下，您说的转化，还需要转数是干嘛的，我们只是在温箱里面培养...

shy8610

回复 miRNA 的帖子# M4 c8 _7 t! L6 c3 Q+ S$ Y

8 }. K! v0 C# q" u9 k8 ^楼主能详细说明一下，你们插入什么类型的目的基因，因为我们实验插过一个慢病毒的一个包膜区，也是大片段，5k作用，需要在30度，180转才能长好，温度和转数都要低一些，我们的感受态是top10，一般转化培养条件是37毒，220转

shy8610

回复 miRNA 的帖子
( y0 `$ `8 x; a
/ w+ j) |& n' S: [3 m6 ~* R9 ?楼主能详细说明一下，你们插入什么类型的目的基因，因为我们实验插过一个慢病毒的一个包膜区，也是大片段，5k作用，需要在30度，180转才能长好，温度和转数都要低一些，我们的感受态是top10，一般转化培养条件是37毒，220转

miRNA

回复 weiyepan 的帖子# c0 Z7 H6 a' }" V7 N( L, m6 r
& W0 \* G4 a& s% u- `$ J
插入的片段也仅仅是核酸而已啊，转化也并不涉及到蛋白水平啊，怎么会对细胞有毒性呢？
  C: P6 s, f# [" _5 [9 R; ~1 N, h仅仅是转化而已...

miRNA

回复 youzi821 的帖子
' x  a# u- `, y" h, k8 M2 _( Z. k; S2 @0 P0 g! W2 ^' m
虽然我并不知道基因是否是温度敏感，但是根据常识，应该是跟温度有关的，但是我做的仅仅是转化，转到DH5a里面，长单克隆，因此，不涉及到蛋白...

miRNA

回复 lxm5668 的帖子: u; a7 _* I1 V
6 c/ ^, d" d' @8 h6 y. t; p- V# y  u
您可能做的是原核表达以后纯化标签蛋白，因此涉及到蛋白水平，但是我做的仅仅是转化诶，然后长单克隆而已，所以，只是核酸水平吧...

weiyepan

这有可能是因为你插入的片段对细胞有毒性，37度长太快的时候细菌承受不了会死掉。