请教一个关于iPS的技术问题

markllq

最近一个实验需要在重编程过程（MEF中过表达SKOM）中利用shRNA敲掉某个基因。shRNA用的是慢病毒载体PLKO，knockdown的效率很高。但对MEF细胞的毒性非常大，我把病毒稀释到平时用量的4倍，感染时间缩短到了4个小时，细胞依然死的很厉害，估计最终很难出克隆，最郁闷的是实验组和control死的细胞数目还不太一样，根本没法比较效率。剩下不死的细胞状态也很差，边缘很亮，感觉像是接近凋亡。我们实验室以前做重编程用的都是逆转录病毒载体（pSuper），基本没有毒性，效果是很好的。这次之所以用PLKO而不用psuper是有特殊原因。最近因为感染的问题花费了很多时间和精力，也深感这当中学问很大，但是我经验不足，问题最后还是没能解决，想请问一下大家有没有人试过用慢病毒载体的shRNA来感染MEF研究重编程的？能否给一些建议？如何能降低毒性？多谢！

stemcellmeng

我使用过慢病毒系统的pLKO，但做的是其他细胞的诱导分化重编程。建议你可以先用pLKO的病毒对细胞进行感染，然后用Puro筛选（我们的pLKO是带有Puro抗性基因的，你的不知道是带什么抗性）后让细胞恢复一下增殖，再重新铺细胞进行重编程，这样在短时间内基因的Knockdown 效率可以维持，同时也不会使细胞死的太多。而且可以尝试在感染的时候不要加Polybrene之类的感染辅助试剂。还有就是不知道你的病毒是不是浓缩过，我之前用的话都不用浓缩的，因为可以进行筛选，所以如果还是死的多，可以继续降低感染用量。

markllq

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( X* j  J9 o" [9 ?2 W+ r% q
, s3 t1 T% w6 g$ j3 ]我们实验室做重编程都是用原代的MEF细胞，从来没试过拿传代过以后的细胞来做，MEF这种细胞很脆弱，衰老很快，可能会对效率的影响较大。对于细胞死的很严重，我们可以通过减少感染时间来尽量减少死细胞，最棘手的问题是实验组和control死的细胞数目不同，这直接导致效率没法比较，结果不可信。这个有没有好的解决办法？是不是需要把病毒离心，从新定量到同一滴度就可保证实验组和control一致？

markllq

回复 stemcellmeng 的帖子* X& }4 B  @7 ]& G% z- V& W; P

. c' t( F( |: J" j我们实验室做重编程都是用原代的MEF细胞，从来没试过拿传代过以后的细胞来做，MEF这种细胞很脆弱，衰老很快，可能会对效率的影响较大。对于细胞死的很严重，我们可以通过减少感染时间来尽量减少死细胞，最棘手的问题是实验组和control死的细胞数目不同，这直接导致效率没法比较，结果不可信。这个有没有好的解决办法？是不是需要把病毒离心，从新定量到同一滴度就可保证实验组和control一致？

stemcellmeng

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* d' |) S' |% q' p# }0 b哦，原代的这种感染我们没做过，不过MEF尽管老化快，但传个4、5代是可以的，或者现在有那种p53q敲除的小鼠，既能使细胞增殖代数多又能提高重编程效率，可以看看附近的组有没有可以借一下。如果你们有固定的protocol不能变，那就根据你们的步骤来做吧。这个细胞数目死的不同的话就是通过病毒来控制了，可以采用同一批包的病毒中的同一管或者几管做个Mix来同时感染实验组和对照组，不离心应该也可以，原理和你说的离心后重新定量差不多。对了，你的对照组是转了None targeting 的shRNA ，然后没转SKOM吧？除了这个我也想不出好的办法了。

christophe

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( v* F3 q7 [: x! w' |, G4 F8 Y; A2 f- f" ]
如果你knockdown的基因对细胞的增殖存活很关键，比如细胞周期相关的基因，只要感染上了病毒，细胞没法继续存活，那肯定会死很多。不知你要knockdown的基因是不是这种类型的基因。如果你knockdown的基因对细胞增殖没影响，那就要把病毒滴度调到一致，或者都过饱和。

markllq

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$ |$ l! r; D3 S: R, X  u
; e9 V# c; G6 n谢谢！对照组是SKOM加none targeting的shRNA，实验组是SKOM加目的基因的shRNA。我准备尝试一下把病毒滴度调齐后再做感染试试。

markllq

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& K3 Y7 m" k' M9 b+ l7 t% |
; V+ D$ z, ~8 h- y) A  u6 s- D/ _谢谢，原因应该是后者，这个基因敲低后本该促进增殖的，准备尝试调节病毒滴度后做感染。