琼脂糖凝胶电泳

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【实验目的】 3 E! T6 g7 g* y; F
（1） 学习琼脂糖凝胶电泳的基本原理；$ n% A" Z+ |  ~7 k/ L
（2） 掌握使用水平式电泳仪的方法；; l# ?0 P3 m9 w. @  {
（3） 学习在含有甲醛的凝胶上进行RNA电泳的方法。. ?; r% [/ K0 B9 b# `; v2 V1 b
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【实验原理】
5 J7 ~7 P" |. C; r  M琼脂糖凝胶电泳是基因工程实验室中分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：$ L. [. ?: j7 X$ s
（1）DNA的分子大小。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。
8 D% E5 E' v' L) H  R* W# h（2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。# [8 h* I4 o& D* i$ R' U% j
（3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。" N: t/ V: C- B7 T( U
（4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
0 O. W. w. v2 c3 j% p8 D) x$ s9 g$ c溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)（1） 能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑， 所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。
; F/ T1 i% E, V$ u& C# e常规的水平式琼脂糖凝胶电泳适合于DNA和RNA的分离鉴定；但经甲醛进行变性处理的琼脂糖电泳更适用于RNA的分离鉴定和Northern 杂交，因为变性后的RNA是单链，其泳动速度与相同大小的DNA分子量一样，因而可以进行RNA分子大小的测定，而且染色后条带更为锐利，也更牢固结合于硝酸纤维素膜上，与放射性或非放射性标记的探针发生高效杂交。3 T* R' L( Q6 p. a4 A

5 T8 X9 a) ?5 x" S【试剂与器材】
! e8 t& M1 T3 }: k（一）材料
8 y: u! B$ Y. k6 ~7 z% b' `电泳仪、水平电泳槽、样品梳子、琼脂糖等' Z6 l) u1 l$ W( U
（二）试剂# g$ I% u/ b8 V* X' }8 L6 B4 D- j
1、 50?TAE(1000mL)：242g Tris,
0 t: S9 o: X* \; Z57.1mL 冰醋酸，; A/ z! H- p# g3 R& L, }
18.6g EDTA。
& n2 g0 k5 |! X# }* Z1 G3 Y% w) v2、 EB溶液：100mL水中加入1g溴化乙啶，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，分装，室温避光保存。
% R# M/ y( b' q5 g3 q! X' ]: N% g: _3、 DNA加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，50%甘油（w/v）。
; z& m  A4 q! x' A$ r$ s4、 RNA甲醛变性胶上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，1mM EDTA(PH8.0)，50%甘油（w/v），用DEPC水配制，高压灭菌备用。
+ f- T2 _0 _4 ]% L7 S7 j5、 5?甲醛变性胶电泳缓冲液：0.1m MOPS(PH7.0)，40mM醋酸钠，5mM EDTA(PH8.0)，用DEPC水配制，过滤除菌，室温避光保存。淡黄色缓冲液可正常使用，深黄色应弃用。
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【操作方法】
" n9 D1 n( a7 t6 E( ]! j  {* ~（一）常规的水平式琼脂糖电泳
& \9 R! ~4 q4 i( A' ~$ ~9 F2 O制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表：. M- C0 t# u2 H$ H' _' ?$ S/ W
琼脂糖的含量（%） 分离线状DNA分子的有效范围（Kb）
2 z6 ^( B! z8 E) A0.3 60-5
" W7 E, z4 ^  D2 F! m% e0.6 20-1- [/ V! K" Y9 P5 D! d
0.7 10-0.8
: t( K! W; M& L4 N1 s0.9 7-0.5
/ m2 Q6 B* m& w3 ^9 W1.2 6-0.4, C+ ]; D* j, q' F) E
1.5 4-0.2
/ n6 P3 Q: D" e8 z( X& F2.0 3-0.1
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1．制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1x电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。
  Y5 Q8 O2 U. v  F* T2．胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，加入最终浓度为0.5微克/毫升的EB(也可不把EB加入凝胶中,而是电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色15分钟)，摇匀，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；
" e# |% ]3 T& C2 e- x3．加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。$ I- J" U6 N6 @( p
4．电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。当琼脂糖浓度低于0.5%，电泳温度不能太高。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。7 W3 w( A9 y. j8 O9 Q3 C
5．观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后（2）的或已加有EB的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。于凝胶成像系统中拍照并保存之。9 Q; H: o4 z# e
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（二） 在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳（选做）7 ~7 U) o0 h' J
配制23 mL甲醛电泳胶：0.336g琼脂糖溶于20mL DEPC水中，冷却至60?C，加入5mL的5x甲醛变性胶电泳缓冲液和5.5mL的甲醛，在通风橱内倒胶，冷却30分钟后使用。
8 t, {& f3 N. _# d$ a7 S, v甲醛变性胶RNA样品的制备：1μL RNA，5?甲醛变性胶电泳缓冲液0.5μL，甲醛0.7μL，甲酰胺2μL，65oC加热15min，迅速冰浴，加1μL上样缓冲液和0.2μL的EB。
( u) L) `9 y0 n& _# A- V: V步骤：
1 }5 y: \: e1 v" n. Y' M1． 用3%过氧化氢浸泡电泳槽、胶板、梳子30分钟以上。
1 J8 s# l! q& Q9 `/ t2 I% L4 A2． 胶板的制备：按常规琼脂糖电泳法。
0 p& {+ t/ l0 p/ X3． 预电泳：1×甲醛变性胶电泳缓冲液，预电泳10 min。电压为5V/cm。% v6 i3 @7 m0 e/ K$ M
4． 小心地进行点样，记录样品次序与点样量；然后开始电泳，电压为3-4V/cm。* E7 d" t4 \( {' v
5． 观察和拍照：在波长为254nm的紫外灯下观察电泳胶板并拍照保存图片。9 g  F1 `! P/ O5 I6 h( ~% g

) ~/ ]7 p) y4 v7 h  C【注意事项与提示】
( x: ?0 P  c" p4 ~) l* g, A（1）EB是强诱变剂并有中等毒性，易挥发，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。简单处理方法为：加入大量的水进行稀释（达到0.5mg/mL以下），然后加入0.2倍体积新鲜配制的5%次磷酸（由50%次磷酸配制而成）和0.12倍体积新鲜配制的0.5mol/L 的亚硝酸钠，混匀，放置1天后，加入过量的1mol/L碳酸氢钠。如此处理后的EB的诱变活性可降至原来的1/200左右。
  q& E; k/ z! \& c% C（2）由于EB会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使DNA迁移率降低。因此，如果要准确地测定DNA的分子量，应该采用跑完电泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色的方法。8 r7 H* w* Q7 P$ K5 p7 l
（3）总RNA的分析：哺乳动物的RNA由28S rRNA、18S rRNA和mRNA以及其它小分子RNA组成，28S和18S rRNA处为明显的亮带（相当于4.5kb和1.9kb），28S/18S应为1.5-2.5/1；植物、昆虫、酵母和两栖动物的RNA带分布较小，约为0.5-3.0kb左右；假如28S/18S小于1/1，或者出现拖带，说明RNA已经有部分降解，如果28S和18S rRNA大部分已降解，则需重新制备。' `8 t1 n& S3 C& n

1 h5 x* f% [* T# b【实验安排】 / M1 y, n. s8 J6 \( W3 V
只需一天：上午配试剂倒胶，下午跑电泳并观察拍照。
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