PCR克隆基因酶切的问题

daviddow

如何解决酶切后没有条带的问题？
) V* E& f+ [2 i4 y1 SPCR产物：N42% B' R3 f: s) b3 A
9 M- `, U8 w" }; Z% i
5 `- Q9 {4 ?1 J/ c
酶切后：PCR-N4-BamH
* H2 i* x2 K) E+ u" i8 e! U
' q9 ~% v" S0 J% B* G# |5 E& Y
+ `2 m7 C' B: C. ^: E
  D; C- C* v0 o) `酶切的条件是：5 m  w. L/ K+ ?! o  S
Nuclease free water     40ul. p; |; M7 C+ r
BamHI Buffer          5ul
) G" I8 w1 x/ M. kPCR product           ul
$ ?+ D$ L: B9 e% k- L9 S* HBamHI               2.5ul
- k2 H! w2 B" o. e" `* Z  eHindIII               2.5ul+ S2 t% `& b0 f) X4 P
②: mix gently and spin down for a few minutes;
8 P1 y2 T1 t6 P" n/ u/ L③: incubate at 37°for 3hours
8 ^5 V2 a* Z$ u0 b

刘森泉

通过酶切其他载体检测酶是否有问题；通过PCR检测载体是否有问题；第三就是酶切反应了，这样的体系一般没有问题，因为你的BamHI Buffer不适合切HindIII，至少单酶切可以成功，一条条带至少应该有。

风雪叶杰

酶切之后没有条带？建议先检测下酶的质量问题吧，还有buffer。就算切不开也不至于把片段弄没了，只有可能是降解了，这两个酶都挺好用 的，不会有什么大的星活性

b6122

2 X7 z+ u  I3 w# A" Z! q6 o4 ]

( y* K- u, l. y7 F7 v- {我切bamhi和hindiii的时候用的neb的buffer 2 （10x），我在网上搜了一下，配方如下：
( Z, Y3 R4 I6 D0 J; Y7 v5 N7 E7 O3 v1X NEBuffer 2:
+ q9 u# v9 i1 S: C# v! {9 R8 {9 L50 mM NaCl# X$ L# M' y$ Z+ F; I, I+ P9 T8 Z
10 mM Tris-HCl" d; U+ @& I7 J1 t: t/ V" K4 _+ \
10 mM MgCl2
$ P, r  ~( z5 T) ^4 e# P1 mM Dithiothreitol
/ N: z: |7 O2 U5 j- y: OpH 7.9 @ 25°C% R* X& i  \0 w$ d+ @
这个buffer条件下，两种酶的活性都最高# g4 P4 n0 D0 F, F+ c

: Y& [* H' g0 u/ J, t另外，你pcr产物跑电泳后回收胶有没有问题？

daviddow

b6,你说的回收胶有什么问题？不知道什么意思？谢谢！我是沉淀了一下就酶切，没有跑胶。

daviddow

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" v+ \2 ~: Y+ \: T4 ~# K0 y, B; d" O- K% v
我的是fermentas公司的内切酶，这是他们推荐的内切酶。我切了质粒以后没问题，但是PCR酶切后就没有我需呀的条带了，都到了100bp一下了

daviddow

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1 I1 z$ k5 }8 [" P0 u# B' a" h; l, X% ?# z* I
谢谢风雪，不知道哪些可以降解PCR产物？我的质粒没有问题，就是PCR产物都降解了

lazyworm

即使酶切没切开也应该有一条带吧，一点东西都没有要考虑前面的实验是否成功了。

youzi821

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: g* K& {; o* A9 s# Z) b% ~7 q# P5 M8 x  r
fermentas的酶，你看下酶的最适孵育条件和时间，超过30分钟，BamHI有其它活性，最近我也遇到这个问题，把酶切时间缩短，如果是快速酶的话，15分钟左右就可以，不要孵育那么长时间。

youzi821

而且一般情况下双酶切需要用通用buffer，请按照你买的试剂公司的条件来做。