脐带间充质干细胞无血清培养基培养后的冻存复苏活力低的问题

thomassun2008

我们实验室最近在试用gibco stempro xenofree 间充质干细胞培养基，有个问题一直困扰着我们，gibco的说明书上建议用90%stempro xenofree 完全培养基+10%DMSO冻存细胞，细胞冻存前活力95%，然而细胞冻存后的复苏活力很低，仅有30%-60%;我们也用90%FBS+10%DMSO冻存，结果一样。现在我们分析可能冻存液没问题，是不是用stempro xenofree 培养的细胞比较脆弱，一冻就死呢。我们可是严格按照他们的说明书上操作的，不知道用过stempro xenofree 培养基的各位是不是也遇到过这种问题，如何解决呢？

zhujiang007

细胞冷冻复苏活率受很多因素的影响，可以考虑以下几个因素：1. 向细胞加入冻存液（DMSO）的方法，应为缓慢逐滴加入，且不断摇匀细胞悬液；2. 尽快放入梯度降温盒中，由初始温度逐渐降低到-80度；3. 复苏在37度水浴锅中迅速解冻，且迅速加入到培养基当中摇匀，坚持缓慢稀释DMSO的原则。这一步方法有两种，有的离心去掉DMSO，要注意离心的转速；有的直接加入培养基，24小时后换液，也可以不换液，每个人的观点不一样。

happyending

-80度能保持细胞活性多久呢？

meister

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0 k# Q: e5 }) K! M: Y' q0 J) r
各种细胞不一样， 细胞系一般时间较长， 几年后都能复苏成功。

happyending

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- z1 _+ U2 U  |7 n1 j& O
6 N" ?# r9 `/ P" a间充质干细胞能在-80度保持多久啊？一年有木有问题啊，还有如果放在液氮里面的话，是不是可以永久保存呢？

meister

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; d$ S* g3 f- Z+ b
+ ~1 U  b8 g) a7 G6 M( b一年估计不行， 3-6个月问题应该不大。液氮可以永久保存。

meister

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5 q% k; S1 E+ G- J( Q2 N/ W2 |* {9 g
随着-80度保存时间延长， 复苏效果逐渐降低

happyending

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/ A' C& z7 j# R- {  g; L; v! Q1 g9 I
' b6 F3 n) B8 s2 H恩，好，了

thomassun2008

经过几次传代，我们发现在无血清的条件下，细胞好像只能到达80%左右的融合度，有没有可能是细胞到了80%的融合度我们没传代反而多养了一天，细胞因此进入平台期？？消化下来后细胞比较脆弱，经不起冻（30-60%活力）？？不知道各位用过无血清培养基的是否有此种可能。

代理人

冻存后一半2种降温方式，一是置入程序降温盒，迅速放入-80度冰箱过夜，第二天转入液氮罐；第二种放入冻存盒使用程序降温仪直接降至-80度，再转入液氮罐比较节省时间。复苏时，水浴锅迅速复温，使用的是洗涤DMSO。离心2次左右，重悬细胞，基本上活率可以达到90-95%不等。本人一直觉得脐带间充质干细胞特别强悍，洁净室A级环境，正确的操作，严格控制生长时间，固定的培养基，基本上细胞都是形态正常，传代一次扩增10倍左右。