主导干细胞研究 激发干细胞潜能-转自丁香园

chineselangzi

人多能干细胞一般被定义为能够保持正常染色体核型并能无限扩增的细胞。它们具有生成内、中、外三个胚层的能力，并可以一步分化为特定的细胞谱系。这促使了它们在各种临床以及人体细胞和发育系统研究领域的应用。
/ X7 C* v! U1 R7 a
+ D  l+ Z1 D9 B. D. m6 s# R人多能干细胞分为两大类：人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导多能干细胞（hiPSCs）。前者来源于植入囊胚中的内细胞群，后者则是通过少量基因的短暂过度表达来实现对体细胞的重编程。可通过创建标准化的方法来制备这些细胞并根据其特性将其分选出来，从而建立稳定有效的ES/iPS培养体系。
9 u, ~1 [8 R. Z: c* I' }$ E7 j
, @" d2 Y$ _3 \4 u5 X目前，培养人多能干细胞的基本技术已被确立，尽管这些程序中仍存在许多的限制，特别是许多现有细胞系，是使用小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）作为饲养层，以及血清或其他动物来源的培养基成分培养。通过提供必要的因子或去除抑制因子，MEF支持自我更新能力。源自MEF细胞培养物上清的条件培养基同样具有支持细胞自我更新的能力。尽管如此，由于以下原因，继续使用饲养层成分和动物来源成分将妨碍临床应用的发展：a）出现免疫学物质；b）存在传播动物病毒或阮病毒材料的风险；和c）难以对这些不确定的成分进行质量控制。因此，这一领域的一项重要进展是界定支持增殖和培养hPSC而无需饲养层成分或动物来源成分的培养条件。最佳的培养体系将包括一个经适当缓冲的培养基（含有自我更新能力和多能细胞存活所需的所有代谢物质、细胞因子和生长因子）以及支持细胞生长的培养基质。
7 d- I9 j2 n1 o/ _0 v
# z& Y1 O( W- a$ K9 ]' _/ K8 d! {8 ^; r目前已有多个研究团队研发出hESC的培养条件；这些条件在不同程度上可说是无血清和不要饲养层。Xu 等报导了一个使用 BDMatrigel™ 作为培养基质和 MEF 条件培养基（由含有动物成分的血清替代物和基础成纤维细胞生长因子 bFGF组成）的培养体系，该体系允许在不直接接触饲养层的情况下培养 hESC。据报导，真实的无饲养层细胞培养使用细胞外基质和由转化生长因子 β (TGFβ) 及 bFGF 组成的混合物或单独的高浓度 bFGF，尽管这些研究依赖含有动物成分的血清替代物。Richards 等报告首个无异种成分的 hESC 培养体系，这个培养体系用人饲养层细胞或成人输卵管上皮源细胞替代传统使用的 MEF。但是，该培养体系所用的培养基被添加了 20% 人血清，并且由于其不确定的性质导致各批次产品间存在差异。
) f+ V+ W+ W3 V1 e, f
9 Q7 |( u4 ]+ U4 @' c/ H) E6 s: b最近，多个文献介绍用于维持 hESC 成分确定、无异种成分或无饲养层细胞的培养基配方。“TeSR” 是无血清、无异种成分培养基，由 WiCell Research Institute (Madison, WI) 的 Tenneille Ludwig 等研发，且被证实支持衍生和在无饲养层细胞条件下长期培养 hPSC。“TeSR” 的配方包括高浓度的 bFGF，以及 TGFβ、氨基丁酸 (GABA)、哌可酸 （pipecolic acid）和氯化锂（lithium chloride）。原文献介绍了由四种人源成分（胶原蛋白 IV、纤连蛋白、层粘连蛋白和玻连蛋白）组成的支持性基质。为降低此成分确定培养体系的日常研究成本，Ludwig 等继续他们的研发而配制了 “mTeSR”。“mTeSR” 虽含有部分动物来源的蛋白质，但仍保留了成分完全确定和无血清的优点，无需饲养层细胞即可支持 hPSC 的自我更新。
! x! V# D$ K: F/ X7 p6 m, r5 |# C8 |# C, X- g5 U4 v9 g
STEMCELL Technologies 研发的 mTeSR™1（产品号 #05850）和 TeSR™2（产品号 #05860），作为无饲养层细胞条件下维持 hPSC 的标准化培养基。它们的成分基于 Ludwig 等公布的研究成果，是完全的、成分确定的无血清培养基，其生产得到 WiCell Research Institute 的授权。mTeSR™1 含牛血清白蛋白来源，用于支持长期、无饲养层细胞条件下培养 hPSC 以及在无饲养层细胞条件下衍生 hiPSC。TeSR™2 则是不含动物蛋白的配方，同样支持长期、无饲养层细胞条件下培养 hPSC。两者均不需要进一步添加生长因子。它们旨在维持和扩增未分化的 hPSC，并与作为基质的 BD Matrigel™ hESC-qualified Matrix（BD 产品号 #354277）配合使用。STEMCELL Technologies 预先对每一批次的 BD Matrigel™ 的质量进行检测，确保均一性、可重复性和可靠性。若要获得完全不含动物蛋白的培养体系，TeSR™2 可与Vitronectin第替代基质配合使用。* B0 m6 E5 k: `6 l3 Q
- K0 ^7 [  O8 u3 I* m6 C+ M
在 mTeSR™1 和 TeSR™2 中培养的 hPSC：/ o1 |. n- k1 V3 ?& \8 l; P

6 z2 A2 s0 b. T9 O·  表型均匀且核型正常: G9 \7 G7 h3 H) m

$ x0 A( n5 [7 p9 S·  表达高水平的多能性标记如：Oct-3/4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-811 M2 I6 j5 ]* S  `% V0 x
; `0 M. J: A; a
·  表达多能性所需的基因：Oct-3/4、nanog
. @' k: o, o1 R4 S# T: N! z' S5 p0 @
  T/ ^0 U2 a% S+ i, R# y$ p·  形成包含内、中、外胚层谱系衍生物的畸胎瘤
" f; z( f7 A& s/ Z$ P1 a/ u0 y9 F
, {& P0 ]( n' y7 M·  可在体外分化为功能成熟的细胞类型（如造血细胞）
, H: y/ |+ ^" F" E% C2 l" J& Y0 Y  A+ |: @( C! G/ v. K
·  从基于饲养层细胞的培养物转化时，不需要驯化培养期（即无细胞低产期）
) m- C) k0 N7 D( i$ h
$ P0 Z2 |: A( T# C0 s* n使用 mTeSR™1 和 TeSR™2 的优点包括：9 O9 Q, Z% u' ~
  d: O/ v% I4 d9 ?. ^( {% _7 T% Q
·  去除不确定的培养基成分和消除与饲养层细胞和条件培养基有关的固有可变性，使 hPSC 培养的条件保持一致性
6 p) V1 V# ]( A$ K
) x2 S/ M5 a' Y·  标准化培养方法，从而提高数据的可重复性* k: ^5 v* E' q5 G0 d; h" {' N, V- B

. w; X5 k1 {* N+ z, I) q  Q' T·  省去制备饲养层细胞或条件培养基的程序，节省了时间和劳力
* A& ~- O7 Q) o7 _, I
& Q; O) G  C  H- U5 V! a·  完全的培养基配方，无需添加额外的生长因子或其他添加物
2 P% K- E( o' r" a7 y  j8 q* M- d+ Y! x* h! H
图1.  mTeSR™1 培养基对细胞扩增效果的一致性。6 B; U: X7 W! F
8 ~6 b2 X+ z) W8 _# g. o3 S
H1 和 H9 hESCs 在 mTeSR™1 中分别传代培养了19代和18代。培养结果显示各代之间均保持7至10倍的扩增。
/ d: n7 z9 L# P. Z6 I
: y/ t: I9 }$ D
5 H! u0 h1 ~* p# a图2.  在 mTeSR™1 中培养的 hESCs    和    hiPSCs 的形态特征。
1 U8 V9 m; D' f- c- @2 F( p' p
- e' M# f! r+ E. y+ A6 [H1 hESCs 的集落具有 (A) 确定的边界，(B) 细胞核质比率较高的特点。hiPSC 细胞系 (C) iPSC(IMR90)-3 和 (D) MSC-iPSC1 在 mTeSR™1 中的维持培养显示了相似的形态特征。(E-G) H9 hESCs 通常每5-7天传代一次。与含饲养层细胞或条件培养基的培养相比，hESCs 在 mTeSR™1 中的形态有少许差异。
! [6 E- ^+ H1 F' a
  L% W* e7 X$ E5 ]4 q& N. K[图3.  在 mTeSR™1 中培养的 hESCs 在长期传代后依然保持正常核型。
! [- O' M; U$ i: N5 {! E" \* \! v3 K8 P5 ^
通过染色体分析表明，即使在 mTeSR™1 中培养了48代的 H1 hESCs，其核型在长期传代过程中仍保持正常。0 b( t% Z* N2 y7 a! @8 _

4 i$ p# B3 H+ t& b$ S# h7 f; h; y: @% R1 [) V" v4 F/ V. K# @+ L
图4.  在 mTeSR™1 中培养的 hESCs 具有多能性。4 q. M% K# t& i1 [
! {2 h7 e  |; @- K1 m# t0 F: ]
H9  hESCs  在  mTeSR™1  中培养了6代，然后通过皮下注射入免疫缺损的小鼠。生成的畸胎瘤包含来自所有3个胚层的细胞类型。照片显示具有代表性的组织类型。7 D+ t& m" Z' ]: ]8 v6 X
! R9 f  ?  M( Z, ?2 D+ \6 ]1 T
另外，与无饲养层的培养体系配合的还有向三种胚层分化的培养基。其中STEMdiffTM APELTM培养基是成分确定、不含动物成分、可用于将人多能干细胞分化的基础培养基。它专门用于直尺人多能干细胞（hPSC）向外胚层、中胚层和内胚层的分化实验。它是由STEMCELLL Technologies研发，其配方基于一份已发表的研究。STEMdiff APEL培养基是一种不含生长因子的多用途基础培养基，允许添加特定谱系的生长因子。虽然该培养基优化适用于在mTeSR1或TeSR2维持培养基的PSC及AggreWell制备的类胚体（EB）系统配合使用，但也可用于贴壁细胞分化系统下进行的分化。( y9 s( l$ T# `# [  d

( N: f' x- R0 Y! t/ C1 y/ H
2 N6 }4 J5 a. @3 p! f# c. R8 p& g图5. 使用 STEMdiff™ APEL™ 培养基和特定细胞因子令 hPSCs 分化为明确内胚层。* y- v6 k$ s( f4 B, ^4 c+ s5 Q( `, n

) i" @; i, N+ v2 uH9  hESCs  的分化实验是参照  Rezania 24   等人的研究成果，并作出了以下改变: (1) STEMdiff™ APEL™ 可以替代含有2%牛血清白蛋白的 RPMI 作为基础培养基；(2) 在分化前，确保细胞在 mTeSR™1 维持培养基和 Matrigel™中至少传代培养10代。
: g2 ~! `- t- M9 P" n  j5 X3 G8 c( q3 O
分化进行到第4天时，细胞中内胚层标志  CXCR4  和  SOX17  出现明显的共表达。(A)  细胞仅在  STEMdiff™  APEL™ 培养基中进行培养  （不加入细胞因子）； (B) 细胞在含有细胞因子的 STEMdiff™ APEL™ 培养基中进行培养。0 f4 Q% U6 }" j
+ R4 M" B; E; @& o( c

- B7 Y5 L/ \/ l0 ~+ `图6. 使用 STEMdiff™ APEL™ 培养基将 hPSCs 分化为心肌细胞。/ A% u, P: ]. V+ d$ c2 [

, {9 \0 |# d7 d# C: ZhPSCs 分化为心肌细胞的过程是参照  Yang 25  等人的研究成果，并作出了以下改变：(1)  STEMdiff™  APEL™  可以替代  StemPro™ -34  SFM  作为基础培养基；(2) 在分化前，确保细胞在 mTeSR™1 维持培养基和 Matrigel™ 中至少传代培养10代；(3) 使用 AggreWell?400 培养板形成 EBs；（4）整个分化过程在 AggreWell™400 培养板中进行。
1 `- s% P* U# M: [$ W5 k7 z" ^' z" g8 N4 I; A
(A)  在第16天时，对培养基中搏动  EBs  进行计数，其比例占总  EBs  数的5% - 95%  (n=9)。(B)  第16天时，使用流式细胞仪测量  cTnT  的表达量。图示为  H9 hESC 定向分化过程中，表达 cTnT 细胞的典型范例。2 g. v1 q- U: x# n
5 R' D8 b6 i  `+ p

# ^! s: r! }7 [图7. 使用 STEMdiff™ APEL™ 培养基将 hPSCs 分化为造血细胞。) M2 i- T" v: D
8 d. C* R7 P( X) c& V6 d
(A) hiPS-4D1 细胞（左）和 H9 细胞 右）的分化实验是参照 Ng 23  和 Chadwick 26  等人的研究成果，并作出了以下改变：（1STEMdiff™  APEL™  培养基可以替代含有20%胎牛血清的  DMEM  作为基础培养基；（2）在分化前，确保细胞在 mTeSR™1  维持培养基和  Matrigel™  中至少传代培养10代；3）整个分化过程采取在  Matrigel™  包被的培养皿上以贴壁培养的方法，而不使用  EB  悬浮培养模式。# j4 r  j$ k0 i6 F0 s* X/ v- \( J2 S' L( a

+ y7 J/ J' U6 g6 |5 ~; Q分化到第13天时，使用流式细胞仪分析造血细胞标记分子  CD34  和  CD45的表达量。(B) 由于 CD34 hi  细胞同时表达 CD31，暗示实验过程中同时生成了内皮细胞。(C)  在12次实验中，平均值为28.0%（±8.6%为标准方差）的细胞在第13天时表达了 CD34, 其中7.3% ±5.1%）的细胞呈现 CD34 +  和 CD45 +  的双阳性表达。" ?8 h4 u, ?2 y5 C+ V. ?  e
4 V0 s* `8 c. f' E7 C4 m
STEMdiff神经诱导培养基则是成分确定，不含血清，用于将人多能干细胞分化为神经祖细胞的培养基。神经诱导是人多能干细胞（hPSCs）向神经祖细胞（NPCs）分化的第一步，在此之后NPCs将继续分化为中枢神经系统的各类成熟细胞，如神经元，星形胶质细胞及少突胶质细胞。神经rosette结构，是体外神经诱导时出现在早期的一种易于识别的形态学特征。
' Y) X5 }# a/ F5 \# C" @
. c6 V( q, i/ E3 d+ \STEMdiff神经诱导培养基是一种成分确定的无血清培养基，可以配合其他产品组成一个可在短至12天内成功诱导人多能干细胞分化为神经祖细胞的完整培养系统。STEMdiff神经诱导培养基配合AggreWell800板使用，可以迅速有效地形成神经rosette集落，产生大小性状一致的神经细胞聚集体。
' a8 _& {# U/ o+ Q; l
& g# Y$ y. x3 X6 d' K使用STEMdiff神经诱导培养基形成的神经rosette群落可以使用不含酶的STEMdiff神经rosette分选试剂进行筛选及分离，以用于下一步实验。以上试剂组成一个完整、方便快捷且高效的培养系统并可以在12天内得到纯度高达100%的单个神经祖细胞，而不需要任何手动操作分离神经rosette结构。  H$ C5 `3 a" e; r. g9 V, K
" W0 q; b! X( Z) x8 H( U+ C
" a1 p7 G: X# B7 o& P% B
图8. 使用 STEMdiff™ 神经诱导培养基可以达到100%的神经细胞诱导率。
3 ]1 k4 @& O' V. ?0 N9 P9 T  q! t8 _1 Q
含有10,000个细胞的神经细胞聚集体是通过使用  STEMdiff™  神经诱导培养基和  AggreWell™800  培养板，每天更换¾的培养液，而在5天内形成的。然后将该聚集体接种到含聚左旋鸟氨酸/层粘连蛋白PLO/L）包被的培养板上。图中所示为2天后粘附在  PLO/L  培养板上的神经细胞聚集体中明显可见的神经"rosette"  结构(橙色箭头标注)。该样本中，100%的神经细胞聚集体有超过50%的区域覆盖了"rosette" 结构。% l0 x! r8 O  q& ^% H: R

4 v$ P: D# q/ E1 R, m/ T; x1 n9 i, ^/ Z, h' I- e
图9. 使用 STEMdiff™ 神经 "Rosette" 分选试剂选择性分离神经 "rosette" 结构。
0 O# y, d7 F. |2 Z6 j0 `2 i) G( c( \2 c
将神经细胞聚集体接种到含有  PLO/L  包被的盖玻片上并且固定，1天后进行免疫细胞化染色。"Rosette"  结构可以用一种早期神经祖细胞标记物  Pax6 染色 (绿色)，边缘区域的 "平整" 细胞可以用一种神经嵴标记物 SOX10 染色(红色)。蓝色为核标记物4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）可以对所有细胞核进行染色。+ D% R! z& |  x% q% l* |
5 J5 o* f2 K& P
4 l4 F: `7 F# n% @8 ^" F; ]& o
图10. 神经细胞聚集体边缘区域的 "平整" 细胞为 SOX10 阳性。
  f# V( @3 a  G. r  K, H6 H* l: [1 w
(A) "平整" 细胞多出现于神经细胞聚集体的边缘区域（橙色箭头标注）。图示为在 PLO/L 上培养7天后的神经细胞聚集体。! p! A  X( s7 I3 _. T: @

: Q( _! U8 S# p+ V  X% B. l(B) 与 STEMdiff™ 神经 "Rosette" 分选试剂孵育后，神经 "rosette" 集落从培养板上脱离。
# A8 [( v! o. v1 N* U) B  Q) Y* A& P; C. N& ?
(C)  使用  STEMdiff™  神经  "Rosette"  分选试剂后，"平整"  细胞仍然黏附在培养板上。
) o% L8 X1 ?! \3 ?; F9 a2 ~# H2 d6 Y, O" d3 ^3 ?/ O. {; r. G: Q: T
(D) 经分离、重新接种而粘附在 PLO/L 上的神经 "rosette" 集落，几天后显示生出的神经祖细胞。
- Z3 S% j/ h+ v& ~7 H# j$ X8 i ' N5 N/ h; n, V/ ]! i, a) P
% y" L7 K6 `% R7 h% O; @: C
  @% x2 Y- o+ `# p
编辑: helen
& F5 Z* e1 Q" C7 S/ O. p) q