MEF培养

huangcong1988

之前分的MEF，状态还不错。但是冻存复苏后，细胞贴壁的很少（冻存过程我敢保证没有问题，因为我试过用棉花包着4度﹣20负80，也试过程序冻存盒），冻存液我是90%血清加10%DMSO(这个冻存液应该来说还是很奢侈的),DMSO是amersco的，血清gibco的。由于细胞贴壁少，我就试着将几瓶细胞集中到一个瓶中养，细胞长得还是很慢，满了之后我传代，发现传代以后细胞就污染了，细胞间隙里面很多小黑点，像沙子一样，我也不知道为什么，分MEF的时候细胞还是很正常的，状态也很好，而且我直接冻的是原代的，按理说细胞应该很好复苏，但是复苏后六个小时，细胞没怎么贴壁。求战友指教！PS:有一个问题就是，这几天我们培养箱二氧化碳罐有点问题，可能二氧化碳浓度不能较好保证，但是个人觉得这个是个次要因素。

wangyu

回复 huangcong1988 的帖子, D: `- k' G* y0 Z" r" Q( |3 J9 ]

0 q9 G4 w* p; w* j. A7 A你试一下，1：3：6来配的冻存液* e, b5 r" f/ r4 a
就是DMSO：血清：有血清的DMEM=1:3:6

huangcong1988

回复 wangyu 的帖子$ `5 Q: X. D# g1 f' {4 J8 I# ^

$ c8 ?# s0 o4 G6 ^这样能好一些吗？按理说血清浓度高，应该更好啊，之前用这个冻存液冻细胞还是很好啊

huangcong1988

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( j! Q: w3 |* h% @0 ~" Q% W% O6 N+ Y( E+ P
还有一个问题就是，我配的冻存液的DMSO没什么气味，一般之前我用的DMSO都是很大味道的，很刺鼻的气味，这个DMSO是新买的，amersco的，原装的，但是还很便宜，好像500ml才400块左右，不知道是不是这个问题

lily46555

原代冻存是不是还有杂细胞？

Andyhigh

可能存在的问题：1.你冻存的比例太小
/ a, W  L- B2 p5 R                            2.有个细节：应事先配好冷冻试剂，让其冷却，不能细胞、血清和DMSO一起加，对细胞有损害。另外我用的
  Z" L* H* t4 `: H/ D& w% [" u8 K0 L                                                DMSO味道不是很大，味  道大的是冷冻盒里面的异丙醇。, z: u' E) @& D- N0 G* Q; @
                             3.我做过的原代MEF解冻后，也出现过小黑点（有些比较大，中空的），不过并不影响细胞的贴壁。具体是什么我也不知道，应该            
+ C# b0 K! Q- p" U0 s                                不是问题所在。# i* Q6 z- Y) l% D
                              4.培养瓶的问题，试着换一批培养瓶试试，或者换一种细胞解冻试试。
1 g* Q3 `- J& J7 s+ u1 v5 F                               5.污染可能是操作有问题。培养箱应该也是原因的一部分。3 j! l3 H" \! j$ A+ ]' |
                              6.胎鼠取材问题：几日龄取材、MEF制作过程可能有问题。3 [$ k8 M% r0 a& N) W- y
                              7.冷冻体系问题：我们冻存是直接-80过5h以上，在液氮保存，可以参考下。还有你冻存时间（-80）也应该考虑下( w" |5 J! U6 v  \6 l  t
1 {" N9 z2 M! l( L# ~' S

wenBQ

血清渗透压很大吧

184lj

你用这么高血清比例的冻存液，你解冻复苏时的media中血清浓度也要求高一些（20%），贴壁后再换到正常浓度media（10%），MEF细胞冻存密度要比普通细胞高2~3倍这样；还有可能是你解冻时的操作环节出了问题。

huangcong1988

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% M4 \5 Y7 S0 h$ B- C非常感谢，其实之后我试过，问题现在解决了，真的是复苏的时候血清浓度应该适度提高一些，我提高到15%，结果复苏就有很多活的细胞，细胞慢慢就养起来了

wshtcl

我做的时候都是按照   DMSO：血清：纯培养液=1:4:5的比例，用分级冻存盒来冻存的。复苏的时候在40℃的水浴中让其完全化开。这样做，细胞的状态挺不错的。