贴壁细胞传代问题

lmh_yixue

培养的子宫内膜细胞（没有分离腺细胞和间质细胞）原代培养到第五天时已经铺满皿底，用0.25%的胰酶传代，消化5分钟后细胞上面有亮点但细胞本身没有变圆，然后加入几滴PBS后吹打，不容易吹打下来，大学吹打了15分钟才下来，然后离心。为什么获得的细胞沉淀很少呀，是不是消化有问题？原代需要消化时间长吗？

sanna1

你先用胰酶洗一下细胞，去除残留的培养液，再用胰酶消化了嘛？

romanyuo

洗了以后，加上胰酶不容易消化下来，可以放到二氧化碳培养箱里孵育一会，肉眼看细胞呈磨砂片状，然后再吹打就容易了！

lmh_yixue

回复 sanna1 的帖子7 G( |( r  P, y4 D$ h  B# `

3 p9 a" ]9 B- F嗯，我用生理盐水洗了两遍又加的胰酶。是不是我就是没有消化好，不容易吹打下来所以就使劲吹，最后损失了细胞。

lmh_yixue

消化的时机怎么把握呀？消化好了是不是很容易吹打下来？我每次传代都花好多时间，就是吹打浪费时间

lmh_yixue

回复 romanyuo 的帖子
* t% ~1 b" Q8 r7 z, v7 j  b; }: V9 E% u5 Q' V$ g) k
放到培养箱里大约多长时间？我为了增加效果，胰酶在用之前我已经把大约1ml的胰酶放在培养箱里5min又用的。之后加到培养皿中，然后把加过胰酶的培养皿放到孵箱大约5min。细胞不容易吹打下来，但又不敢再消化，害怕损伤细胞。我做了几次，原代细胞都比已经传过代的细胞不好消化，不好传代，容易失败。

lmh_yixue

怎么办？怎样提高效果？另外我如果加上培养液终止消化总是吹出气泡。于是我加1.5mlPBS稀释胰酶后吹打，气泡少了很多，也比较容易吹打，这样对细胞没有影响吧？

sanna1

回复 lmh_yixue 的帖子
* H2 j+ {9 K3 v- J7 W
4 q; P: z/ S6 r! r2 b先用胰酶洗一下，再加2ml胰酶于75cm culture flask的细胞上37oc消化2分钟，去除胰酶，再加2ml 的胰酶消化5分钟左右，试一试吧。

aulenuyah

（1）子宫内膜细胞消化不下来，怀疑可能细胞老化了吧，你的细胞大小、形态如何；, V# u! }" R8 D6 e3 }2 U5 Y
（2）培养的细胞上皮样的多还是成纤维样的多？如果上皮样的多，消化需要的时间比较久的；5 O4 l# }- ^' ?% R7 s
（3）吹打结束之后在显微镜下观察，细胞是否还在，数量如何；4 t/ x% n6 K6 M0 f1 D0 c  E
（4）离心的时候转速是不是大了或小了。

lmh_yixue

回复 aulenuyah 的帖子4 Y# Q& C  Q6 o5 `( l. A5 e

9 P6 X/ N* M+ }+ }. ~3 [非常感谢！4 @- [) ^- z, z, g
1，细胞老化是有可能的，最近没有传好的有两次，一次是原代：多数细胞呈菱形散在分布（系间质细胞），也有细胞呈漩涡状排列（系腺细胞），细胞比较密集。另一次是P1传代，这次细胞可能老化了：细胞呈方形的小细胞，排列极为紧密。
# k7 w0 w) L. {& a1 Y2，上皮样细胞比较多，消化多久合适？! [# Q- i2 Y! w; a# C
3，吹打结束后观察皿底比较干净，细胞数量非常少了。
$ r+ W+ T' N/ c. b4，离心的转速也考虑过：分别用1500r/min 和2000r/min试过。之前成功的时候一直用1500r/min。