贴壁细胞传代问题

lmh_yixue

培养的子宫内膜细胞（没有分离腺细胞和间质细胞）原代培养到第五天时已经铺满皿底，用0.25%的胰酶传代，消化5分钟后细胞上面有亮点但细胞本身没有变圆，然后加入几滴PBS后吹打，不容易吹打下来，大学吹打了15分钟才下来，然后离心。为什么获得的细胞沉淀很少呀，是不是消化有问题？原代需要消化时间长吗？

sanna1

你先用胰酶洗一下细胞，去除残留的培养液，再用胰酶消化了嘛？

romanyuo

洗了以后，加上胰酶不容易消化下来，可以放到二氧化碳培养箱里孵育一会，肉眼看细胞呈磨砂片状，然后再吹打就容易了！

lmh_yixue

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8 L) Z+ F' r+ L: J. ^, X嗯，我用生理盐水洗了两遍又加的胰酶。是不是我就是没有消化好，不容易吹打下来所以就使劲吹，最后损失了细胞。

lmh_yixue

消化的时机怎么把握呀？消化好了是不是很容易吹打下来？我每次传代都花好多时间，就是吹打浪费时间

lmh_yixue

回复 romanyuo 的帖子  o7 p+ A$ H8 k9 i( m
& _) q8 \: }* e, T% J
放到培养箱里大约多长时间？我为了增加效果，胰酶在用之前我已经把大约1ml的胰酶放在培养箱里5min又用的。之后加到培养皿中，然后把加过胰酶的培养皿放到孵箱大约5min。细胞不容易吹打下来，但又不敢再消化，害怕损伤细胞。我做了几次，原代细胞都比已经传过代的细胞不好消化，不好传代，容易失败。

lmh_yixue

怎么办？怎样提高效果？另外我如果加上培养液终止消化总是吹出气泡。于是我加1.5mlPBS稀释胰酶后吹打，气泡少了很多，也比较容易吹打，这样对细胞没有影响吧？

sanna1

回复 lmh_yixue 的帖子0 l- l" E" m! Q5 Y5 f7 }

9 L1 }0 n5 q9 c( H8 B% e5 g先用胰酶洗一下，再加2ml胰酶于75cm culture flask的细胞上37oc消化2分钟，去除胰酶，再加2ml 的胰酶消化5分钟左右，试一试吧。

aulenuyah

（1）子宫内膜细胞消化不下来，怀疑可能细胞老化了吧，你的细胞大小、形态如何；
. S, P. z% b' z- @4 ?& F( m! C* j（2）培养的细胞上皮样的多还是成纤维样的多？如果上皮样的多，消化需要的时间比较久的；& e  b6 D' D/ `1 @0 z8 P9 o
（3）吹打结束之后在显微镜下观察，细胞是否还在，数量如何；
. o, V. l1 Z7 A3 S5 Y) J' X$ X（4）离心的时候转速是不是大了或小了。

lmh_yixue

回复 aulenuyah 的帖子0 H5 {9 W4 ?6 \. j: u9 Q

5 b# G; t( e% N3 k  J  n3 {" b非常感谢！( h. P$ }" d) D6 {! Q/ I6 u
1，细胞老化是有可能的，最近没有传好的有两次，一次是原代：多数细胞呈菱形散在分布（系间质细胞），也有细胞呈漩涡状排列（系腺细胞），细胞比较密集。另一次是P1传代，这次细胞可能老化了：细胞呈方形的小细胞，排列极为紧密。' ~1 ^- F: Q( z  w( D, f, \
2，上皮样细胞比较多，消化多久合适？
3 w. ]6 ^' N* r* [. ^) K3，吹打结束后观察皿底比较干净，细胞数量非常少了。1 i+ b" x7 A' o7 Q
4，离心的转速也考虑过：分别用1500r/min 和2000r/min试过。之前成功的时候一直用1500r/min。