有关“肿瘤细胞株能用来培养出干细胞吗”一帖读后的思考与问题

jojomayer

看了“肿瘤细胞株能用来培养出干细胞吗”一帖后想到好几个问题，本来想回帖，但是打出来发现有点长，很想探讨一下这个问题，干脆再开一贴。$ j( W2 [$ m; }
+ j# _% n& U+ f9 a- ^
首先有一个不成熟的想法，如果普通癌细胞能在某种条件下转化为干细胞样细胞的话，是否可以采用：杀死干细胞+抑制普通癌细胞向干细胞系转化 这种原则来治疗？$ r) g4 u8 F; ~4 N. b) F
7 k7 X# ~3 n8 y  r
另外，有关实验技术完美时，肿瘤细胞系任何一个单细胞都能在动物体内生成一个完美的肿瘤，这个我还真不确定。
; g# G. x, A4 L$ W这样的话，许多文献中提到的“动物体内的成瘤性是判断肿瘤干细胞的金标准”也就不再适用了，因为手术刚切下来的肿瘤，处理之后不分选直接原位移植，貌似也能成瘤(不确定)？
' ~- d! C: L  P7 M, A9 T) X0 t! i: o- P  n
那么已建成的肿瘤细胞系和实体瘤标本的真正区别又在哪里呢？
# T# U4 ~/ g1 v- D! p0 T+ h* d2 r4 i. `0 J, V. X6 l! |# V
在肿瘤干细胞实验方面，我所了解的胶质母细胞瘤干细胞样细胞研究早期，当我们把CD133+作为筛选干细胞样细胞的“比较普遍承认”的标志的时候，' I% p6 R2 {% r6 z
有人做了实验，1000个CD133+胶质瘤干细胞样细胞在裸鼠原位移植后能成瘤而100000个CD133-细胞则不能成瘤。
; x* o. i6 {1 k, R, i+ m, @2 d3 ]: ?) B8 ^5 ^- s9 T) _
但是后来又有人用CD133-也做出了原位成瘤的裸鼠，看来一方面是这个干性标志物还有待改进，另一方面也有可能普通细胞系和干细胞系确实能相互转化。2 l1 p" q: J  J
2 T) g6 u3 \+ F6 ?" I0 H
那怎么转化呢？就我所看过的文献，显然普遍认为干细胞系向普通瘤细胞系转变就是分化，也就是在无血清培养基里加血清诱导分化就可以了。# i& m: n. q; ?& q( X6 g
此时的概念是干细胞系可以不均衡分裂，也就是干细胞可以无限增殖+分化，而瘤细胞只能有限增殖。此时的有限增殖(只能传有限代)我也不太确定了，/ i3 d! ~% ~* A! K# |: h/ a- e) G, {
因为可以买到的那些胶质瘤细胞系都是用普通含血清培养基代代相传的，那算不算无限增殖？$ |& q. A: z( \
  E3 ]7 ?# t2 ?& Q8 m
而普通瘤细胞系向干细胞系转化的方法，我真的没有看到谁专门就这个问题详细写过。目前仅仅知道所谓的无血清培养，
6 t0 N5 r: Z$ W& e包括sphere assay神经球悬浮培养严格来说仅仅能算作一个“富集”干细胞样细胞的过程，因为即便是严格的由一个干细胞克隆生长而成的一个神经球，/ ]# r% b& G7 ~3 F. t; _, ~/ A
也有异质性。目前认为里面包含着干细胞样细胞，前体细胞，少部分已分化的普通瘤细胞。也就是说，: j+ J; d0 P& n3 r' F* U: X* h6 \
仅仅能促使存在于整体中的极少量干细胞系在适当条件下(无血清+生长因子刺激培养)“脱颖而出”，而留下其他的“非永生的”普通瘤细胞逐渐在数代之后死亡。1 j* m# U# d+ R2 v1 O  R
# w: c5 h: ]3 V+ a& r7 v7 ~0 I
那么具体应该是几代？
( p. u7 W$ g, M& t% v) p6 u* S; t- W( U8 t% t: B- P8 k0 h: C' N
有人认为是6代。我看了这个说法的参考文献，; }, M0 _1 p! p2 e0 h* Q
一篇Harris MA, Yang H, Low BE, Mukherjee J, Guha A, Bronson RT, et al: Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma. Cancer Res 68:10051-10059, 20080 s/ B2 C+ w: h9 Y- \
是无血清培养基+生长因子刺激下可以传25代。而后为了证明其含有干细胞，特别的又去掉生长因子再试一遍，可以传代，没说能传几代。
, _2 [: r' `4 v$ @  g& O. t另一篇Louis SA, Rietze RL, Deleyrolle L, Wagey RE, Thomas TE, Eaves AC, et al: Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells 26:988-996, 2008& f  p/ d& r$ ^+ b$ G! s
明确提到了能传6代以上的概念。也就是说，要做干细胞实验，最好选择传了6代以上还没死的细胞。
; _4 T$ o8 x; y但问题又出现了，基于干细胞样细胞的不均衡分裂性质，每一代干细胞都能产生新的普通瘤细胞。所以看来整个细胞群体的组成还是处在动态平衡的状态，不太可能通过传代的方法剔除普通瘤细胞。
9 v$ C4 R8 `+ @; _; b( P0 [
4 \5 X0 j% U6 J+ G: R# @回到上一段中，又有一个问题，生长因子在干细胞无血清培养中具体都起了哪些作用？为什么最初开发这个方法的时候要用生长因子？体内的情况和加了生长因子的胞外环境都有哪些不同？. P3 F- _8 }" s' _: F9 V

2 G& {; L) n3 X! O' k, Z4 A我感觉自己在这方面很多想法还不成熟，所以抛砖引玉，想请大家也谈谈自己的看法，便于学习，谢谢。

ljcc

回复 jojomayer 的帖子2 w6 H) c  U6 E  R  s* ]
1 ]2 k1 _. s9 p7 f
1、“因为手术刚切下来的肿瘤，处理之后不分选直接原位移植，貌似也能成瘤(不确定)？”. s- s  A4 s6 R5 h
临床上肿瘤手术要按严格无瘤手术规范，如不然，会在切口处产生种植，手术后肿瘤细胞脱落也可在瘤床种植。所以肿瘤细胞可在原位种植，但未有报道在异体种植，也许异体有排斥作用。
9 A7 j; p; a! G& \+ ^/ N0 E2、干细胞与普通肿瘤细胞的转化：干细胞肯定可转化为普通肿瘤细胞，且时间较短，在一定条件下大部分都有可能不断分裂出肿瘤细胞且速度较快。理论上普通肿瘤细胞在一定条件下也可转为干细胞，但肯定时间较长，也只能是少数。故本人也同意干细胞研究要传代6代以上。3、无血清培养是否普通的肿瘤细胞均不能生长，G0期细胞能生存吗。

ZHUTZ

       普通肿瘤向肿瘤干细胞转化已经证明过，即所谓的“返祖现象”，这恰恰是目前许多试图通过免疫细胞等所谓靶向杀灭TSC的软肋，因为杀灭TSC后普通肿瘤细胞返祖又前功尽弃。但个人觉得想通过“杀死干细胞+抑制普通癌细胞向干细胞系转化”治愈肿瘤不太可行，首先因为TSC的耐药性和抗辐射性是普通癌细胞的N倍，药物在杀死TSC之前可能非干性肿瘤细胞已经死光光了不用抑制转化了（没证明过，因为还没这样有效的药物在体内证明能杀死TSC）。另外，即便TSC或癌细胞都没了也未必能治愈肿瘤，因为他们都只是癌变过程的“结果”。他们是从哪来的？肯定是原本“健康”的细胞，杀灭了他们就能保证没有新的TSC或肿瘤细胞再产生吗？个人认为根源还在于癌变周围异常的微环境的压力选择造成，“杀死TSC和普通癌细胞+纠正致癌微环境”或许是将来治愈肿瘤的一个重要方向，但无疑现有的研究基础非常薄弱难以支撑。$ q+ b. ]: z# h3 \
        实际上CD133的确不是最好的的标志物，但假阴性和假阳性除了和CD133本身属性有关外，有时还与我们的实验方法和操作有关， 比如我们消化细胞时用的试剂可以破坏CD133分子，导致原本阳性的细胞变成了阴性，用这样的CD133阴性细胞移植裸鼠可能也会成瘤，从这个方面CD133有时是有点无辜了。但CD133分选后的“干性”鉴定目前是必不可少的。# i! g  |) U6 l' e  O) m& K
         想通过N代培养后得到纯化TSC是不现实的，正如楼上所说不对称分裂。TSC边增殖边分化这个是没有疑问的，就像肿瘤球的周边有大量的趋于分化的细胞。所以目前用TSC做实验只能是分选出一批检测一批，这样相对纯一些，如果分选完一养又会有部分分化的细胞产生。期待能找到一种真正使其只增殖不分化的培养方法，这样也不用过柱子或大流式了劳民伤财的。

lxm5668

看了发帖人的帖子，！
; j6 z. f7 g% q看了ZHUTZ的帖子，又明白了！细胞海洋，给那个ZHUTZ加分吧！

zz091115

想想细胞系的来源 最开始的被选中的那个细胞很有可能就是CSC 只是当时没有认识到CSC的存在而已 至于CD133的问题 这个marker一向就不是什么可靠的marker 当然楼上ZHUTZ的解释的可能是存在的 因为在melanoma中 胰酶就可以消化掉表面的CD271 造成误判 所以在sphere assay中消化还是选用比较温和的酶比较好 sphere assay只是一种富集的手段 并不能保证全部细胞是CSC 这是干细胞分裂时对称或不对称分裂造成的 没法避免 除非能确切的了解CSC的niche 不过CSC的niche非但不一样 甚至能自行创造或是自己做自己的niche 所以 现在想获得纯纯的CSC的培养方法 还是不太可能的

jojomayer

ljcc 发表于 2012-9-14 02:15
6 z3 K0 U: G& l0 [6 f) z* n回复 jojomayer 的帖子
' |; Z5 N( A# T2 l, \- L
3 h4 a8 @. R8 f2 k1 ~1、“因为手术刚切下来的肿瘤，处理之后不分选直接原位移植，貌似也能成瘤(不确定) ...

2 S  t/ S9 M9 |+ D% g1. 是这回事，异体原位移植我是在裸鼠之类的免疫缺陷动物。我没看过直接种瘤块的，但我自己做过裸鼠皮下注射Hela细胞成瘤的实验。3 t7 T+ d0 w; _" r2 `
2. 干细胞可分化为普通肿瘤细胞已经证实，普通肿瘤细胞向干系转化的，我要找找看ZHUTZ兄说的这个“返祖现象”的文献看看。) h* `# a7 O. J3 J! F- g: U
3. 无血清培养条件下是否普通肿瘤细胞均不能生长，我现在还不太了解，我一直是临床医学专业的，现在暂时搞点基础研究。G0期细胞~~~这个真不知道，关键在自己养的细胞中，不知道怎样鉴别G0期细胞。

jojomayer

回复 ZHUTZ 的帖子2 G9 I  t9 O4 m" V2 a% I

3 b. f* u5 H: \0 a: d' F; I哈！ZHUTZ兄说的非常好！我正好之前看到了一篇文献，说这个癌干细胞是结果不是起因的事情。还有人好心翻成了中文版http://bbs.creaders.net/health/b ... 3&blog_id=99407
* l" ?$ t. x9 M) G0 U+ L  k) k2 y+ g
另外还想请问你对于以下两个问题有何看法：# ~1 l) n( p% X# d" g) }2 Y
1. 建成的肿瘤细胞系和实体瘤标本的区别？在能想到的各个方面？' H0 {% A( Z$ L; g9 P/ z% C
2. 买到的那些胶质瘤细胞系都是用普通含血清培养基代代相传的，那算不算无限增殖？
( r1 c/ h" q9 D. x" W; s  d6 W1 Z3. 生长因子在干细胞无血清培养中具体都起了哪些作用？为什么最初开发这个方法的时候要用生长因子？体内的情况和加了生长因子的胞外环境都有哪些不同？
- c0 q; @: O, s, {& s( P
+ M$ V# R6 _2 o& F非常感谢！

jojomayer

lxm5668 发表于 2012-9-14 03:45 1 u. F) x; ~5 q/ Y/ r
看了发帖人的帖子，！
# d* g8 _5 W4 P+ I看了ZHUTZ的帖子，又明白了！细胞海洋，给那个ZHUTZ加分吧！

% x, v, u5 E! e0 ]' X6 Q1 _8 t哈， 不好意思，当时想了许多东西，脑子还乱着呢，随手打出来，思绪都没有整理一下就直接发了，见谅见谅。

jojomayer

回复 zz091115 的帖子3 \9 E4 R9 n. O) G6 J

  y0 x; G, N3 e8 u嗯，感谢回复，有关这个“温和的酶”的问题，比如说我所做的glioblastoma stem cell like cells，使用手术切除标本原代培养消化为单细胞悬液的过程中有几种不同的方案，有的用Trypsin，有的用Accutase，有的用其他稀奇古怪的酶，你觉得那一种比较好？0 x$ e+ D0 [- q4 C
! O$ H7 s  m/ j, x2 s! Z( _
另外实验室的老师告诉我因为Accutase不像Trypsin，它不需要使用抑制剂来终止消化，所以有可能造成染色体的损伤，影响G显带等鉴定手段的结果。而Trypsin可以在短时间内消化然后迅速终止反应，或许能避免这个问题。你怎么看？

ljcc

回复 jojomayer 的帖子9 Q& e0 q. K* ?8 y5 D1 x7 H  I
9 n# Q2 o; C! e& e# m
jojomayer说“关键在自己养的细胞中，不知道怎样鉴别G0期细胞。”
2 Z7 T2 g+ X! Z: i6 HG0期细胞的获得和鉴别
; {( b1 ]( C. \# {　　可采用血清饥饿法得到G0期细胞：
0 @5 H, U" C7 g" E+ D: K　　1．取处于对数生长期的细胞。. E% K* M* g1 T. C: l
　　2．用含0．5%　-　1%小牛血清的培养基培养细胞48－72 h。或用无血清的培养基培养24 h。; N5 A  p1 E1 J5 T3 Y9 ^9 [9 e; `
　　3．用0．1% - 0．25%胰蛋白酶消化细胞可收获G0期细胞，可用’H-TdR掺人进行测量鉴定。