为什么转染的时候有细胞密度的要求呢？

miRNA

RT，比如，Lipo转染质粒建议，转染的时候细胞密度在80%；
+ G, [8 `0 n. n+ h也有的转染试剂，或者转siRNA时，建议转染的时候细胞密度在60%-70%；* s5 Q  s. Y, S+ `9 n
主要是因为转染试剂毒性的问题吗？
6 c0 @+ [" _. J: F* @; Z9 F5 c5 k3 m假如在细胞密度60%的时候转染，那后面再长出来的40%的细胞都有质粒转染进去吗？应该没有吧....% r% P. z  F5 `' n# |7 p' V4 f

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请教..! L( i! u8 l# b  ?. \6 t

% a1 ?: e, n0 M4 B谢谢！

shy8610

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4 N4 r5 j5 Z# R
( o7 t* S' g( l6 ]个人推测是这样的，转染的话，需要预先铺细胞，过夜后再进行转染，铺的时候一般要求50-60%，过夜也许就有80+了，这时换液，转染刚刚合适，细胞太满也不适合，容易长成复层，影响质粒转染，通过对于那些进行荧光观察的，有干扰影响，再回答，60%后转染，后面再长出的细胞，其实也可以部分转染进去，比例多少不确定，另外一般我们转染后都是更换的是维持培养基，一般是不会有那么多细胞生长的。

miRNA

回复 shy8610 的帖子3 T8 M, p. ~% t; U3 p. u# V, l. V

/ }! F: `8 L" M( g' B一般都是说80%的时候细胞状态最好，转染效率最高，可是那从40%到50%生长的时候细胞状态也是出于增殖状态啊........另外，如果"60%后转染，后面再长出的细胞，其实也可以部分转染进去"那是不是需要考虑一下转染复合体在加入到培养基以后能稳定多长时间呢？如果稳定的时间比较短，那后面长出来的细胞肯定也就没有转染进去喽......问您一下，转染后4-6h更换为维持培养基，比如说之前的培养基是10%FBS DMEM，那维持培养基就是不含血清的纯粹DMEM吗？谢谢啦...

shy8610

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9 Q/ Q1 |4 D  ?, K/ K) ?3 m
1 n$ h; S5 B# j  x不知您转染做的多不多，的确，我们一般转293T,tzm一般都是80%开转，我说的50%是铺入的密度，因为生长快，过夜后就差不多80%，至于你提到的60%，我不清楚，可能有试剂盒为保证转染效率，有规定要求，你提到稳定时间，类似于脂质体lipo2000，转染是无血清体系进行转染，复合20分钟后，转染入无血清培养基的细胞中，4小时后进行换液，更换成2%fbs的血清（维持培养基），你说的稳定时间应该是4小时无血清转染时间了，不知这么回答可以吗？

miRNA

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. J' ^* w+ A& I7 x
, q& t1 u# _7 @" @哦，我说的问题太没有逻辑了，整理一下哈:* I/ {, F2 ]( }" f4 D. m( o
A. 您的转染实验是这样的吗:第一天接种细胞，接种(铺入)密度是50%===过夜到第二天，细胞达到80%密度准备转染===(转染之前需要将细胞培养基从10%FBS更换为无血清培养基是吗？即，在无血清体系中进行转染，貌似lipo说明书上没有要求这么做嘞，这样更好吗？)===开始转染，配置转染复合体，复合20分钟后，转染入无血清培养基的细胞中===4小时后进行换液，更换成2%fbs的血清（维持培养基）===24-48h后分析结果；7 N- n: e) i5 y7 z9 E
B. 我说的稳定时间是指，从转染入无血清培养基的细胞中开始算起，转染复合体能稳定多长时间？因为有的转染试剂不要求换液，那转染复合体就一直在培养基中，如果一直能发挥作用的话，那不就一直能转染入新增殖的细胞里面吗？(当然，好像正常人都不会考虑这个问题哈哈)。

xiongjiedeng

很简单呀，太稀疏了，转染率低；太密了，细胞生长状态不好。正如楼上的战友所说，一般70%——80%最好，当然不同细胞也有差异咯

niliu730323143

60%-80%都是挺好的，理论上来说，会存在未转进去的细胞，而且增值会快一些，所以设计的时候在质粒上会加个抗性基因，后期用抗生素筛选。

niliu730323143

正好，刚做完一个实验，细胞计数后少除了个4，结果密度是预期的1/4,第二天细胞长到20%-30%，依旧转染，48h后结果是：双质粒转染全挂了，单质粒转染10%，空白和mock活得好好的。这个结果让我有点摸不着头脑！