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linhua188

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发表于 2012-10-25 10:54 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

细胞培养基础2 F1 e- B1 \! g1 g+ z* f/ d$ Z0 {
& \4 |" q' d7 l! @
常用设备

准备室的设备： ; \# W1 z" i# r0 s# e: d  J6 r6 p6 U
单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。 & X+ d+ J  s' I* z
培养室的设备：
液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。 ; H. r9 ]) s% S0 m" C

无菌操作 . p" I9 U$ N; O+ l# Z6 p0 S4 F
) s: {+ @/ P- H$ d- i, X/ T
无菌室的灭菌：
1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。
2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射
3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟
4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。 ! m8 E: D, }! T/ _, m! P
实验人员的无菌准备：
1.肥皂洗手。 / R9 O& B, f0 L+ a7 V) a  V* {; ^
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋
3.用75％酒精棉球擦净双手。 - s% F) h/ F+ z) _  h2 ^
无菌操作的演示： 4 j* q6 \) ]2 m& b
1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面 4 n% j! V" @' u0 x
2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌
4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。 * c5 ]0 i- B' v0 J' z
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。 1 `/ N1 D& H- i% f8 g8 \3 s% P
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器械的清洗和消毒 . I/ `: r$ }9 V2 e6 C3 R/ N/ o
/ g* B& E8 E0 j+ ?( i: S
玻璃器械洗消：
一、新的玻璃器皿的洗消：
1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。 8 l, X5 W. Q! ~/ J( {" `  q7 |/ _
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。 ( `. E4 y8 \8 g* _1 ^
4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。 - P: E$ N( m8 g
6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。
7.高压消毒后烘干
二、旧的玻璃器皿的洗消：
1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。
2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。 0 S! N. m7 f9 d6 a0 \! U7 m- @; Y. k
3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上） : R' n7 o. ]  p' G. S
5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。* b  T9 p9 Q; H1 u; \% k
金属器械洗消：   L# ^# [- f6 t
金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。 ( l1 t  ^6 e& C+ ^$ R/ W4 E
橡胶和塑料：
橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序： 1 V; m0 s9 D/ ]
1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。 + H4 Z, G! l' U1 [& i3 ?
2. 胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 & n" k: d  L& ^+ Q/ ]; y
3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
4. 胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。 8 D( `5 V( o2 m6 q1 p3 ~
5.塑料培养瓶，培养板，冻存管：   a+ W5 o' T9 I
6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时__这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC12·6H2o)2g，30％盐酸10m1，蒸馏水88m1。 / B8 a/ b/ D' b# N
注意事项：
1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。 ; Y$ {+ q) x+ I" R: s
2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。 3 s* A* q) r3 X" j. i- w( \
3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。 $ t7 A$ [( V& v, K& }: d8 g

细胞培养用液的配制与消毒
器材与试剂：
干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。 6 c+ G# G2 j+ y3 `% ]7 `
具体步骤：
一. 水的制备： / H$ y: N5 B) v) ~" [
细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水 7 _+ ^1 {6 j9 i4 L$ L
二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)： 4 F7 l" h% \3 _$ L; k) Q$ m" I
1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO40. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 . `+ b7 U1 N7 @1 @# m1 B
三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒： 7 E7 M* m* o7 P/ f
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。
2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

四.青、链霉素溶液的配制与消毒 ) E3 i1 K1 h5 U# L
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1. 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。
2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。
3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克.
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五.RPMI1640的制备与消毒： 0 N5 ]6 x# Z5 J: [, L
1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。
2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。 % c4 v% t; T. y8 X' Y4 }* J7 F
3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。 : \' _* Y1 k$ q8 a0 I* h  ]$ E
5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。 & G9 h6 p6 B' z

六．血清的灭火： : J0 b  f# `! D+ m2 E- Y6 E
细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。

七.HEPES溶液：
HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：
准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。
注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。
0 R' ?, F$ s1 c8 }
八.谷氨酰胺： ' g9 T8 M+ D9 I0 ]* o! s
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 " [: ~9 q5 b: Y9 P1 x
0 w5 t9 g; U% \  e% f& k. a
九.肝素溶液的配制： - s' t# _0 t4 z( k5 X
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为℃ 。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。
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十. Ⅰ型胶原酶：
0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。
( u+ j- m4 F, h5 c6 p, O0 c
十一.明胶溶液：
因为明胶难于过滤，所以配制0.1％明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中， 4℃保存。

其他培养用液的配制： # E! \+ T3 G5 P! r. a" E# P: _# N  g
20ug/ml内皮生长因子，

注意事项： ; d. d7 ?  I. Z$ p$ |! [8 G8 O
1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。 $ |' D! r0 y' ~6 @% J! ^, N( F
3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。 0 h7 x" \8 N) e3 q3 n' x1 e
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细胞传代培养（消化法）
3 I* @, o1 J' e: Y* b
具体操作： ( W' p/ Z1 J" d$ X9 R

一. 传代前准备：
1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 2 R$ u9 X" L9 U! l7 T6 ~8 N$ J% Y
5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。
6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
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二.胰蛋白酶消化； # Y# y7 ~7 u; j4 h# K/ x8 i
1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 6 ~) A0 J- Y7 q9 W4 Z
3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 / v# ^2 x0 B0 _# K. t' Z' u( p

三.吹打分散细胞：
1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 7 {, c8 n5 q+ b4 A' [
2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。
4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 " ]" R4 Y: ^  S* Q- |3 K* l2 _

四.分装稀释细胞：
1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 5 Z# m# H; G, ~
2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。

2 k6 t) }! n1 A( O2 h$ `( o, ~
五.继续培养： . l+ q8 r+ |5 V3 [4 I* y+ s
用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。 7 c' B+ _: i# I; H

传代细胞培养注意事项： % J8 l& ]) r/ K4 U
1.严格的无菌操作 3 L( W, f2 W2 o' t# D; p
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。 8 U$ b  N- G! C" f) `# s: k% V

附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方： $ w: ]- L1 Z  k1 j. m( |4 E
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g，葡萄糖 2.00g，0.5％酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。

细胞的复苏 - b3 W: h1 ], t1 A
细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

具体操作

一. 实验前准备：
1.将水浴锅预热至37℃
2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 0 P4 |0 g# N* I' }3 [+ ~/ K  c

二．取出冻存管： - Z& y3 a6 S! q) S+ b; t: Q2 Q$ G
1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

三．迅速解冻： 8 r( v+ g; d* n  X& ~
1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。3 c$ T# B9 ]+ W+ l" \9 Z

7 ^8 g5 I6 X! [1 u
四.平衡离心：
用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min
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五.制备细胞悬液：, _- H% L9 D" t% e# k6 K! k7 w
1.吸弃上清液。 5 `& s+ i3 R% b
2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。
& H* B' X( K2 L3 j) Q6 i
六.细胞计数：
细胞浓度以5×105/ml为宜。 % [7 p$ i, O$ K* K$ G
" |$ i5 x6 _- C- P$ t
七.培养细胞 8 Z" f% \' K$ ]6 e# @7 M
将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。 ) N8 L0 E4 D0 H1 {& ?

初学者易犯错误：
1水浴锅未预热或者未预热到37℃。
2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 9 E7 A0 ?. ~: I9 `! r3 ?( y# I- {; [
4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
7 M; F' q+ r9 p  t2 Z/ m- T$ r+ W2 e, Q8 O
细胞计数
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的* @7 J" a; {" q9 E% u! v
数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：
一.准备工作：
取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待& x) d- u, l+ F- J
长成单层后以被使用。
二.细胞悬液制备： ' e, D7 A. ^' u
细胞悬液的制备方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或- a: d5 {& R5 t% ]# F
Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。
三.细胞计数：
1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。 1 M5 A0 L/ f  S5 N
2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染) u$ m& A" M0 g8 ]
液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细
胞和死细胞。
3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘
缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁/ p; }+ @! u6 T5 X$ M- C
边槽中。 . W  o9 S# U$ M1 W2 M
4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数
板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）
中没有被染液染上色的细胞数目。   ]+ K# [% p, i6 K/ p7 d
5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：
（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4) ×2×104 * V$ ^7 b  M5 ~9 |" ~
说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：
; q. l, G  V- {' V3 N; E
1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3 5 ~- E" T: d4 o. z( Z
四.细胞计数要点：
1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进3 c2 x; `0 `2 n; V8 t3 z. a4 |
行离心再悬浮于少量培养液中；
2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 , S) P% H/ l9 Y' H- j
3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都# B) N2 c6 B7 r3 V
要混匀，以求计数准确；
4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如: v, t& ~0 _4 y% R6 B7 J  ^5 {
果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。
5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
五.初学者易犯的错误： 4 \' F; R" B; G5 \/ c3 {
1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。 : ~6 F; ]4 ^& E6 k+ T4 ]. R
2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。 * E  Q# l# W& U+ a/ ]9 e
六.本实验特殊试剂的配制： " X5 O$ f' P* f4 D' \6 h
4％台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤6 V( l: k9 \) U/ R6 R' K6 U
纸过滤，4℃保存。
使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4％即可。 , `) i5 G5 M: z; H' E6 b  ^/ U
细胞的冻存
1.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。
2.接着置于-20℃冰箱，约30-60min。
3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。
4.置于液氮罐中长期保存。 " }) x: ?" }/ H( N# J- [  T9 {
5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。
注意事项： : h6 v0 n3 B- R- a1 Y
1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破0 C  B, x, a8 _3 A
华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配
制时最好戴上手套操作。 8 z, m/ C% o$ Y$ ?" M2 u' n
2.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这
一温度区内，是“危险温区”。 ' i; f: k! t' b- e+ z9 x! B
3.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。