细胞培养从头学～～ - 肿瘤干细胞专区干细胞之家



免疫细胞治疗专区	欢迎关注干细胞微信公众号

返回列表

查看: 26819\|回复: 5	go 细胞培养从头学～～ [复制链接]

linhua188

注册会员

Rank: 2

积分: 70
威望: 70
包包: 35

楼主

发表于 2012-10-25 10:54 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

细胞培养基础% Y/ e9 F, T+ p* w3 A: }1 ~5 Y

常用设备
9 i2 g9 h" i; C. W& R# V: O
准备室的设备： 9 b0 G; a" L* B4 y4 s( ~" \* o
单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
培养室的设备：
液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。
3 x$ S2 Q7 X6 \
无菌操作 " F% s( Z9 l5 R- r9 p! v

无菌室的灭菌： 7 t9 R7 i) ], A3 A0 ^
1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。
2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射
3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟 ! [- w9 p) n! Y
4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
实验人员的无菌准备： 1 R* w' l4 ?8 O7 b; C2 V
1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋 . q, k5 m  j& x! d6 ]- b
3.用75％酒精棉球擦净双手。 : o2 p: w9 [9 I/ F' L6 C
无菌操作的演示：
1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面
2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌 ; _" l+ ?( |  e# {+ a
4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
; g3 W- O3 t" B  D9 a+ j, [
器械的清洗和消毒 7 u( v+ p( l6 E* t$ |( E1 U
. R, }# Q9 j7 D8 G
玻璃器械洗消： 4 Q; @' d- L4 z. I
一、新的玻璃器皿的洗消： , \+ X8 s( m9 i" K' h; p+ B
1.自来水刷洗，除去灰尘。 / z. Y# w9 E0 ?, m
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。 8 [- [- A8 ?  K
4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。
5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。
6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向15磅时，维持20-30分钟。
7.高压消毒后烘干
二、旧的玻璃器皿的洗消： 1 Z; E$ O+ A% W# C: T8 _, g
1．刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。 6 O8 Z# x( j5 E: w
2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液），12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗3次。
3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。 . u+ C+ v5 U# E3 b, {6 `
4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出3-5分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向15磅时，调节电开关维持20-30分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上） . O  ?3 u4 M3 S$ O4 |
5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。
金属器械洗消：
金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压（30分钟）消毒，再烘干备用。
橡胶和塑料： 0 Z/ u" x3 O" R- Y
橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序： % [/ d: {) o! L. E
1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上(凹向上)，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。
2. 胶塞烘干后用2％氢氧化钠溶液煮沸30分钟（用过的胶塞只要用沸水处理30分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。 8 Q( X. J) E% E6 _4 g& r8 k+ j: L) x
3. 胶帽，离心管帽烘干后只能在2％氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液30分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。最后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
4. 胶头可用75％酒精浸泡5分钟，然后紫外照射后使用即可。 / v% O. ?1 D, z0 ~" a+ V
5.塑料培养瓶，培养板，冻存管：
6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用70％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时__这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻(CoC12·6H2o)2g，30％盐酸10m1，蒸馏水88m1。
注意事项：
1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。 9 P+ \1 Z& m1 l
2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。 . b* w, K9 E1 O, ~6 |" P7 `/ t
3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡：A.泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止泡酸不彻底。

细胞培养用液的配制与消毒 2 S; r5 g; d8 W3 H* y0 W4 i
器材与试剂： / V! v7 L' W9 j$ i
干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。 ( `( k9 ^; i. _/ R- l& `3 b
具体步骤：
一. 水的制备： ; J2 I8 B( u7 Z0 `/ {* ]7 K
细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水 : Y) @6 f1 t/ J% z
二.PBS的制备与消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：
1.溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO40. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。 2 ?& w; W. F' A
2.移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。 ( B2 J& l7 v+ ~! `& m- \) P
三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒： # F+ z" g  T  e7 l+ M0 F+ f1 i
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。搅拌混匀，置于4℃内过夜。 $ w( B8 x0 T* b- r2 I5 L
2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

四.青、链霉素溶液的配制与消毒

1. 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。
2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。
3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克. , ^6 ]+ N) R" x% W& X
4 ~( h& ~& Z( _* p- L6 v9 x5 g
五.RPMI1640的制备与消毒：
1.溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。然后用一个当量的盐酸和NaOH调PH到7.2左右。最后定容至1000ml，摇匀。
2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。 * i. S% d8 b! P, E- t: o
4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。 4 E  y% a+ p) h# E2 a( P9 ]
5.使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。

六．血清的灭火： ) f4 |* n  L# \5 @/ y% U
细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭火30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。 ; J! y; x; @* a! D$ Z' ]! D. V

七.HEPES溶液：
HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’-ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：
准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。过滤除菌，分装后4℃保存。
注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。 / Y/ Q. G+ m! i0 ^! M" u
& H' M% j* U% r6 U/ }7 o; o+ e' R
八.谷氨酰胺： 8 F( Z- L3 k4 G( h% v# Y
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 ) Y  P6 o4 h$ p/ ]

九.肝素溶液的配制：
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为℃ 。使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。

十. Ⅰ型胶原酶： 3 \) A+ U1 G  X# G
0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入10ml小瓶-20℃保存。

十一.明胶溶液：
因为明胶难于过滤，所以配制0.1％明胶溶液必须用无菌的PBS配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）—即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入50ml小瓶中， 4℃保存。 . x) S. m  q+ r' R1 r9 G

其他培养用液的配制： ' p. N2 Z% L, h. M" R
20ug/ml内皮生长因子， 5 l. a* Y7 a7 N3 S0 @
$ e3 J' T' p- R
注意事项： ; G: P- M9 v( n) Z( X
1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。 5 f, D3 {4 m% w( g+ m
2.安装蔡式滤器时通常使用孔径0.45微米和0.22微米滤膜各一张，放置位置为0.45的位于0.22微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。 & v2 x4 G# J' c0 y$ C1 N
3.配制RPMI1640培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液PH值最终为7.2，可在配制时调PH至7.4。
) G- q3 v6 |" N5 T" ]: m
细胞传代培养（消化法）
: p% J  r+ ?0 R6 }
具体操作：
& j: ?' V$ N  a+ L
一. 传代前准备： ( ^% X6 c  K9 E1 [" Y
1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 / ]( [* V6 L& O1 m6 t; r3 P* }
3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 ) V3 |( r6 }- ~& A
5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 + Z- y# }/ j9 M+ _* x, ]
6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 4 ]% t0 a& w$ }) e7 T% {/ G

二.胰蛋白酶消化；
1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 3 J) u+ r+ ]) V! @  o. n
: y1 N: j- m' O6 x! H
三.吹打分散细胞： - X3 w2 H! ~0 y; x# \
1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 : @! W" D2 R( \& R' l
2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 8 O9 W7 _* z& u0 {6 I- g6 n& M
3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。
4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 + a9 e( s- I! z7 x) ~9 p5 O; R# t
+ T1 y# G& a+ S6 @8 W" e0 \
四.分装稀释细胞： # i& [/ ^6 W( A: C1 f8 A6 E
1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。) `4 c4 H7 ]  d* y# \( q$ n6 S+ J
" X! i$ _8 M% U+ G

五.继续培养： * p8 w0 U- R+ h. [" f4 J5 }
用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。 4 b' v5 U* f9 \  u3 V0 ~6 Q. u, p# F

传代细胞培养注意事项：
1.严格的无菌操作
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方： # a/ m$ h: ]' _1 U" @' n' n
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g，葡萄糖 2.00g，0.5％酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。

细胞的复苏 & M: q) c+ ~2 U+ }/ H
细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 : d  D5 m; |7 c5 e; V
  I7 V$ ]) w! a6 Q
具体操作 ! P" S! ?' [9 _

一. 实验前准备：
1.将水浴锅预热至37℃ 3 D1 p; S  e0 h( G( M
2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。

二．取出冻存管： ! Z- y+ j5 G4 v. m. |5 N
1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。$ K0 J% ~, d# w1 e: l. ?) p/ T

三．迅速解冻：
1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 8 g7 J0 m' Z8 Y6 p, Q4 V
2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
" i  u0 t0 t8 ^5 D/ h* U3 z% h
5 s" H3 M' s4 t- [* y8 V; r
四.平衡离心： ; Z# X- f* d( ]4 D" Z
用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min

五.制备细胞悬液：
1.吸弃上清液。 3 p0 A; D: }0 i; _
2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。

六.细胞计数：
细胞浓度以5×105/ml为宜。 8 @  l  f+ B) S/ b% M

七.培养细胞 9 Y* W9 O) \6 Z
将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。
; z8 q5 j' J2 m( y8 Q. @% d3 Y
初学者易犯错误：
1水浴锅未预热或者未预热到37℃。 8 u# p, ~, _% h1 i
2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 / V, {0 c! y; T% c, a7 ^
4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。

细胞计数 ) Y0 I, h& n& Y# I* ]. A& O% E! d
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的% W' r7 U5 z. E: T$ q
数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作： 8 f" t; u+ i: i, ?) V/ R6 x# `4 w
一.准备工作：
取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待
长成单层后以被使用。 * y6 J4 f5 _4 n' f; V. a
二.细胞悬液制备：   K. {* Y. k; W, _: U
细胞悬液的制备方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后，加入培养液（或( A1 S0 T7 c% M. g* |9 q" I
Hanks液或PBS等平衡盐溶液），吹打制成待测细胞悬液。 # d" m! C! e  z
三.细胞计数：   [: x7 D2 L" g* L- o! [4 T
1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。 2 L" B8 A  V8 K
2.制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染
液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细) p. }/ j; B+ J" N' N! f
胞和死细胞。 3 x2 I! X3 H5 i7 B
3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘
缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁
边槽中。
4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数, l  L- L4 p/ I+ b7 t: b( L
板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大铬（每个大格含有16个中铬）2 i" ]  w; {2 }! L3 g7 Q3 b
中没有被染液染上色的细胞数目。 - A" Y6 h+ A7 S( \! Q
5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：
（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4) ×2×104 9 S: J& o7 Y; g7 {
说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为： - j) k% O. c" |9 p& I: H
) ^" P1 D  V" Y
1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3 2 |, p3 H5 S; y; B
四.细胞计数要点：   I3 R0 o5 u  ~$ L
1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进/ u$ ]% o3 p+ U+ s# _
行离心再悬浮于少量培养液中；
2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。 8 v$ J- Y& V# z6 L+ G8 s
3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都* E& u+ V# `2 d0 a: Z8 R# M3 ~
要混匀，以求计数准确； 2 ]3 l4 T# A" N, H+ i7 V) \
4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如
果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。
5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 : N7 W% c. W; L5 U4 Z3 Y; w
五.初学者易犯的错误： * D3 K. k7 x7 h- D) f% a
1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。
2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
3. 滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。 ( A- V5 y( T/ b  n2 ~' s7 q4 T7 |
六.本实验特殊试剂的配制：
4％台盼蓝母液：称取4克台盼蓝，加入少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100毫升，用滤+ m2 ?. a' _; u3 L4 x
纸过滤，4℃保存。 / I( v! @' A9 ^$ I- B3 W% e
使用液：使用时，用PBS稀释母液至0.4％即可。 7 o, ^( L! f1 a% O% ~, x: y& K
细胞的冻存 " ^( O9 F% a3 |: e+ h
1.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。
2.接着置于-20℃冰箱，约30-60min。
3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。 9 R4 Z' ]8 q1 v) e
4.置于液氮罐中长期保存。 : ^3 Z' z# i; R" v
5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。 * ]) I; M, e; F" M( [7 m
注意事项：
1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破8 n- s( ~. x7 V
华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配
制时最好戴上手套操作。
2.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这
一温度区内，是“危险温区”。
3.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。