为什么刚刚解冻的胶原蛋白酶和胰蛋白酶就直接使用的消化效果都很差呢？

弑之使徒

我是用双酶消化法提取脐带MSC的，但最近比较懒就直接用负20度的胶原蛋白酶和胰蛋白酶放在常温下解冻，来消化脐带，却发现这样直接使用的消化效果很差，细胞数量也只有放4度冰箱隔夜试剂的十份之一，而且消化效果都很差，大部分脐带都并没有消化下来。
# D$ Z" `, U+ T; N8 x$ A7 S还有一次性要解冻的试剂比较多，冰箱放得满满的。4度冰箱放隔夜试剂的试剂还未有完全解冻，液面处还有手指头左右大的冰块，我就直接拿出来放在常温解冻，到我使用前已经完全溶解，但消化效果还是很差，细胞只有正常量的十份之一..............& D% P7 i8 f( s! R# d
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为什么刚刚解冻的胶原蛋白酶和胰蛋白酶就直接使用的消化效果都很差呢？

evial

很简单，酶的活性在37°是最好的，其他时候温度越低活性越差，温度很高了也会失活。酶是一种蛋白质啊！

aulenuyah

请描述具体操作，这样的说法太笼统了，根本不知道关键操作是怎么样的

弑之使徒

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) S( ]0 y/ b2 s0 S) z6 h可能是我没有讲清楚吧！
8 i+ G- {! P$ H+ I9 ~% R, L( s方法如下：将脐带 清洗干净，剪碎至１ｍｍ 大小组织块后，将组织块转移至０．１％胶 原酶Ⅳ中，３７℃持续搅拌消化３０ｍｉｎ，随即加入０．１％ 胰酶３７℃继续搅拌，消化３０ｍｉｎ中止，滤网过滤， １５００ ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ。弃上清，ＰＢＳ重悬细胞，１５００ ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ。洗涤２次，以ＭｅｓｅｎｃｕｌｔＴＭ专用培养 基吹打混匀细胞，调整细胞密度为１．０×１０ ／ｃｍ ，接 种于培养瓶中。
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我使用的时候都是用37°水浴消化脐带的，我唯一不明白的就是为什么4度冰箱放隔夜解冻的试剂消化效果要比由负20度转至常温解冻（或试剂直接水浴加热至37度解冻）的效果好？1 N7 T$ [+ [) W: B" n

1 T( B& Y0 t4 o! J2 ^是温度相差太大酶的活性降低？

liuzhihong

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直接从负20拿出来在常温下解冻，因为温度变化过于巨大，所以容易破坏酶的活性！

jihaijie

留意一下你这个酶在冰箱放了多长时间

evial

胶原酶应该是干粉状的吧？现用现配，配好冻的复苏效果都会打折，温差剧烈酶就坏掉了。做实验不可以偷懒的。

jiguojie87

如果是从—20℃拿出来的，最好是先放在4℃融化，这样对酶活性影响最小，如果时间紧蹙的话，也要常温融化，这样酶活性影响相对比较小，等温度恢复常温的时候再用，消化的时候最好能在37℃培养箱中进行，37℃这个环境酶活性最高。

ditiger

实际上酶都是在-20冻存的，但是用时都是拿到37度化的，奇怪，37度化的又快，为什么选择室温呢？

弑之使徒

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) T; x7 B( @; x9 Q# Q- L, I回复 ditiger 的帖子) }; U  s1 B9 v- g% ^
9 k, {# o9 _: ^8 ?9 Z+ D9 v( m
因为直接37度溶解太悲剧了，所以就好奇做个实验看看室温溶解的效果怎样而已，结果还是悲剧的..............