求教：关于丝裂霉素C灭活MEF的相关问题

wzwjiao

第一次做小鼠ES的feeder，分离了C57鼠的MEF，想用丝裂霉素处理一大批细胞，再分装冻存备用，请教以下问题：$ b. m, ?5 m. V# x
1、是否可以在细胞非常密集的情况下，加丝裂霉素？浓度时间如何？是否也是10ug/ml，2-3小时？因为考虑每瓶细胞数多一些的话，可以多冻几管。如果只是刚刚好融合就加药处理的话，一瓶好像没多少细胞冻不了几管呀？) L6 V7 `) p6 d1 L
2、丝裂霉素C处理后，冻存备用的话，冻存哪几种规格好呢？大家每管是冻多少细胞数呀？
( }+ Y$ ?8 G% @% A6 e请各位不吝赐教！先在此谢过诸位！

sdsgliufeng1

你们的C57孕鼠是自己养的吗，有没有好的方法确定小鼠是否怀孕，孕期多久取材的

zttamy

这篇文献对你应该有用

zhusealin

我们用过大量细胞的辐照处理，有条件你也可以考虑用辐照，把所有细胞都集中在一个50ml离心管里去辐照就行了。冻存规格根据你需要的用量，我们一般是1*10的6, 5*10的6

wzwjiao

回复 sdsgliufeng1 的帖子6 O# }& B, |) |) c) h. v& s# a: o

: I( {1 U# _* p' J" U孕鼠是同事帮我养的，12.5天或13.5天取材都可以吧，至于是否怀孕，也是同事帮我判断的，这次3只怀上一只，他们做的多，就看腹部大小就可以判断，但是我自己看不太出来哦

184lj

1、最好不要等到细胞铺满的时候才处理，达到90%汇聚就可以了。
( o' w/ A1 E  f! d2、冻存的时候，MEF细胞的密度是普通细胞的2~3倍；冻存液中血清比例最好高一些（我用50%，效果不错，复苏后死亡的细胞比较少）

kiss2346

3-5代的MEF，培养至80%-90%汇合度,10 μg/mL的丝裂霉素C,1.5 h.1×106cells/管冻存。

荣荣荣

回复 184lj 的帖子
# o# O4 N, b: U
7 V3 y" C: p* d我想问一下是不是我铺10 cm dish 的feeder，我就要复苏10 cm dish所需2倍的feeder？

ruofan1982

回复 zhusealin 的帖子3 C5 B2 p$ I0 `. l
! l/ N& x/ M$ l) m7 P
能否分享辐照的方法，谢谢。比如辐照的射线剂量，时间？辐照细胞数量是否有要求？

zhusealin

回复 ruofan1982 的帖子
* D! m: _+ G- f$ N9 ]  p: X) ~$ [. j/ C& S
剂量30Grey，剂量=剂量率*时间。达到这个剂量就行了。细胞数没要求，我们一次都是照很多细胞的，把所有细胞都离心集中到一管里去辐照