microRNA载体构建PCR老是没有结果~

ielisa

& U, i: M- x+ k, {% n5 s2 X8 v
0 }8 }3 H3 E, s+ C) H1 r小弟要构建两个microRNA的慢病毒载体，同学帮忙一起设计好了引物（使用软件设计），扩增的目的条带为microRNA成熟前体的基因上下游各延伸100bp左右，一共大概三四百bp的大小，然后模板用的是人皮肤细胞抽提基因组DNA（苯酚氯仿抽提法，跑胶可见条带），可是做了几次一直没有P出来，开始时怀疑是退火温度设置不合适，于是梯度PCR也做过了，退火温度从五十多度一直到七十度，也是一个都没有P出来，这是什么情况呢？究竟是哪里的问题呢？哪位大侠做过的帮小弟指点迷津啊！不胜感激，这两天一直在想，都要失眠了~~~1 J9 y6 P' p+ F; E& L; O2 Q& N
模板问题？
3 H1 W6 ~! z5 i; o- ]引物问题？0 y( R4 T6 v- ^' B8 m/ l
还是PCR温度设置问题？
( y3 ?& z9 d9 H  y. X! W求解啊~~~

mzaq2006

试一下巢氏PCR，设计2对引物

燕北飞

赞同楼上的巢氏PCR，设计2对引物，先拉出大范围，再拉小片段。

cellprobe

我当时用的是人的肿瘤病人外周血细胞的基因组DNA；设计引物我是参考ucsc-genome上的基因组序列，我扩增的区域是miRNA前体上下游各200bp；我当时的引物设计软件是Vector NTI. 我只要保证上下游引物的退火温度的差值不多于两度就行；引物扩增的序列是miRNA前体+上下游各200bp,引物的末端是外切酶位点。我一般设计的退火温度都是60度以上，温度越高，越适合模板解链。很多时候，PCR做不出来是因为酶不好，我当时使用的是Invitrogen的酶，扩增能力很强。