microRNA载体构建PCR老是没有结果~

ielisa

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小弟要构建两个microRNA的慢病毒载体，同学帮忙一起设计好了引物（使用软件设计），扩增的目的条带为microRNA成熟前体的基因上下游各延伸100bp左右，一共大概三四百bp的大小，然后模板用的是人皮肤细胞抽提基因组DNA（苯酚氯仿抽提法，跑胶可见条带），可是做了几次一直没有P出来，开始时怀疑是退火温度设置不合适，于是梯度PCR也做过了，退火温度从五十多度一直到七十度，也是一个都没有P出来，这是什么情况呢？究竟是哪里的问题呢？哪位大侠做过的帮小弟指点迷津啊！不胜感激，这两天一直在想，都要失眠了~~~; x% w9 P$ i( d) r" j
模板问题？! \% R; u* j8 q$ c6 X. f
引物问题？# p0 y4 u6 c$ X4 T  c+ f! U
还是PCR温度设置问题？! ~' S; V; P- T# g* S" o* o
求解啊~~~

mzaq2006

试一下巢氏PCR，设计2对引物

燕北飞

赞同楼上的巢氏PCR，设计2对引物，先拉出大范围，再拉小片段。

cellprobe

我当时用的是人的肿瘤病人外周血细胞的基因组DNA；设计引物我是参考ucsc-genome上的基因组序列，我扩增的区域是miRNA前体上下游各200bp；我当时的引物设计软件是Vector NTI. 我只要保证上下游引物的退火温度的差值不多于两度就行；引物扩增的序列是miRNA前体+上下游各200bp,引物的末端是外切酶位点。我一般设计的退火温度都是60度以上，温度越高，越适合模板解链。很多时候，PCR做不出来是因为酶不好，我当时使用的是Invitrogen的酶，扩增能力很强。