原代分离脂肪组织成熟脂肪细胞，得到的细胞数量少

pxw514477866

新手刚开始分原代脂肪细胞，分离脂肪组织的成熟脂肪细胞，按理说应该细胞量很大，但是每次离心纯化后取上清在显微镜下观察发现脂肪细胞的数量非常少，听说离心之后表面是白色的脂肪细胞层，但是每次分都没有看到，不知道是哪里出问题了，这是我分细胞的步骤：: `0 r3 ]  P4 s# F$ r$ C
1.无菌条件采集成体猪（或新生仔猪）皮下脂肪5g置于含1%双抗的PBS（1%双抗的PBS事先配好装于500ml的试剂瓶里面密封）7 m# G, z9 v, w  _) u- h6 F
2.将采集的脂肪组织移入无菌培养皿中，用双抗PBS反复冲洗（至少5遍），用消毒的剪刀和镊子将脂肪组织转入无菌青霉素瓶内，尽可能剪碎。, w- H  w2 p% D& t( s# i* @1 \  Y
3.用吸管将切碎的组织移入10ml离心管，加入提前预热的0.1%（w/v）Ⅰ型胶原酶37℃摇床温和震荡消化1.5h; |& ~* L) m: }6 c( ]/ q
4.消化过后的组织加入5ml含1%双抗的完全培养基终止消化，用吸管充分吹打使混匀，使细胞分离开来，悬浮液过400目细胞筛，收集滤液于10ml离心管中， 1500rpm离心10min
3 H1 E+ v: F$ w5 L% Z$ V5.离心后用吸管小心吸取1ml上清于新离心管中，加入无血清培养基，1500rpm离心10min，重复一遍
( z' {& i( o  S7 [9 `6.用吸管将1ml上层成熟的脂肪细胞（每瓶5×104个细胞）移入到预热加满含15%FBS的DMEM（含有1%双抗）25cm2培养瓶中1 O* G7 z4 v0 ]6 J: J; @
希望高手们指点我一下，分了快2个月了，都没分出来
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suning5

胶原酶消化时间太长，摇床情况下30min即可，胶原酶没必要终止消化，离心去除就行。脂肪的油脂很多，要把油脂去掉，存在会影响细胞生长

guochutao

我最近也在分离成熟脂肪细胞，用的是悬顶培养法，效果也是不会，能够分享几篇分离该细胞的文献吗？

pxw514477866

谢谢啊，因为我要分离的是成熟脂肪细胞，离心后漂浮在上层，但是取上层感觉都是油脂，上层会不会是油脂和脂肪细胞混在一起啊？离心纯化后感觉细胞不多，而且显微镜下如何区分脂滴和脂肪细胞呢？

pxw514477866

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我是用天花板培养法，但是每次感觉离心纯化后的得到的成熟脂肪细胞很少！不知道什么原因？