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细胞总乙酰化水平的快速测定方法 -------免疫亲和色谱-ELISA方法
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0 h: z+ k5 h7 g步骤一：亲和色谱分离提纯乙酰化蛋白
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( R3 y1 t0 {8 r! Z1 }1 H1.用细胞裂解液裂解细胞，10000rpm离心2分钟，取上清备用。
7 }" _' B# j6 E: P# Z2.取20-40 μL抗乙酰化赖氨酸抗体填料(Anti-acetylated lysine Agarose,ICP0388)， 用PBS洗2次，每次1mL。
6 b3 g! T. g+ r& ~9 q+ Q; T3.将细胞裂解上清液与洗好的填料（ICP0388）混匀，39oC旋转摇床低速孵育60分钟。
8 F" h" q- ^) [9 N3 |* K9 f4.1000rpm离心1分钟，去上清，用PBSt重悬沉淀，1000rpm离心1分钟，去上清，重复3次，最后一次用PBS洗，吸弃上清。
- E" m4 F) h/ O6 m6 P( W1 n注：细胞裂解液里应该含有蛋白酶抑制剂，组蛋白乙酰化酶抑制剂等。
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; S2 p! _( n0 U( R步骤二：释放及包被固定分离提纯的乙酰化蛋白
& ~3 d/ I6 L3 ~: A4 W8 u, k1 e- B/ Q5.用20 μL0.1M HCL将步骤2的抗赖氨酸抗体填料-乙酰化蛋白复合物于沸水中煮2分钟，10000rpm离心1分钟，将上清液体全部转移到含有80 μL的0.2M Na2CO3的ELISA薄板上，39oC孵育30分钟；
- q, v. v9 V8 P Y- ^6.取出ELISA薄板，拍干。用PBSt清洗2次，每次均需拍干。加入100 μL含0.5%BSA的PBSt ，39 ℃封闭10分钟。 / C/ j9 d% U7 Z/ t
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步骤三：用抗乙酰赖氨酸抗体HRP标记物检测蛋白乙酰化水平
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7.取出ELISA薄板，拍干，用PBSt清洗2次，拍干。加入100 μL浓度为0.25 μg/mL抗赖氨酸抗体HRP偶联复合物（Anti-acetylated lysine HRP conugates,ICP0381），39 ℃孵育30分钟。 3 X( ~) k3 m+ u" E4 v! R5 N) ?
8.取出ELISA薄板，拍干，用PBSt清洗板孔3次，每次均需拍干。加入100 μLTMB液，39 ℃孵育显色10-20分钟。最后加入100 μL 0.1 M H2SO4终止反应，在450nm波长下读数。 0 q, C" H" [0 a: _ `
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发表于 2012-12-30 10:44
