酶消化法养脐带间充质，求助大神们

湖南干细胞

我用酶消化法，SIGMA的0.1%二型胶原酶消化了在培养箱里12小时，消化效果很不好。
6 S8 J1 [7 A2 S2 \' }放在培养皿（没加盖）里的2份脐带，一份还有组织块没消化干净，一份消化成很粘稠、没什么组织块，（用PBS稀释，消化后的上清液还是自动沉降下来），用50ml离心管消化的没有消化干净，还有很多组织块。离心洗涤后: [5 R% o2 I9 t5 Q; y& j- x
我考虑一下原因：1、消化时间太长，2、剥膜不干净，第一次剥膜；3、组织基本上没有剪成1mm3的；
, h# V% J  W$ w+ h5 \5 q4、离心参数：（因为没过筛，所以离心了3次）。PBS稀释，1500 转/分，5min 1次去组织块，留上清；2500 转/分，5min 2次，洗涤胶原酶。最后很少有细胞沉淀下来。请教以上过程还有什么不对的？有没有改进的方法。

老姜

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你一定要用酶消化法吗？有些文献更支持用脐带Wharton' jelly组织块发直接培养效果不错，减少了酶消法对细胞的损伤作用。我是用脐带组织块直接剪碎培养，组织块法培养原代收获细胞的周期长于酶消法，但细胞不会受到酶的损害作用。一般培养15-20天就收获原代细胞。在此我给你推荐一篇我阅过的文献，以期对你的研究有所帮助。4 A& b6 ]- D, P, u' X5 X1 [8 T
A rapid, simple and reproducible method for the isolation of mesenchymal stromal cells from Wharton’s jelly without enzymatic treatment. De Bruyn Cécile, Najar Mehdi, Raicevic Gordana
8 d/ S5 v* O- L& P/ @( V; d# ]et al.Stem Cells Dev        2011;20(3):547-557 doi: 10.1089/scd.2010.0260) f% }* U- t6 B  r$ g. E

; P  [! u9 s- b; p                                7 f' j  `6 [) T3 E! s+ }% z

wujh1986

1.消化时间并不是很长啊，如果你将组织剪得足够碎，这么长时间后只会剩一点点小小的组织块。
' {% N# b2 E4 f, P2.外膜本很难完全剥离的，尽量剥除，剥不完也没关系的啊。7 a- p3 J: Y# J, M
3.过筛后离心会将组织块除去啊，第一次转数可以提高，时间延长。第二次可以降低，要求大量稀释就好啊，能将剩余酶洗净的。2 Y# W* }' N* |: l4 T
4.离心完的细胞是很难在镜下计数的

湖南干细胞

回复 老姜 的帖子3 h: ?& w* k% K( E- Q' ~
' N! D1 g: L4 B2 i6 N+ @6 I+ {* a
2种方法都在试。我这里网络有问题，现在进了很多数据库都进不去，你能把文章传上来看看不？谢谢。我

pailishi

用酶法也很好的，效率也很高

湖南干细胞

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5 ]0 J0 S& o& i' t1 \
消化的时候，用培养皿要不要加盖？培养皿效果好还是50ml离心管效果好？我的培养皿消化完后里边的细胞很多。用那个牌子的筛网效果好？

莫邪小仙

用脐带组织块贴壁爬片法比酶消化法效果要好很多。将脐带清洗剪碎，将碎块置于培养瓶中，过上一段时间就紧密的贴在瓶子上了，然后再加培养液就ok了。长出的细胞很纯，状态也好。

wujh1986

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+ ^% ]- T( w( K, k* b5 I% n- O! Q  y0 v3 G. g! N
其实消化最好是在那种能摇动的培养箱中，但是仪器很难那么齐全，可以剪碎后，分成两三管在50ml离心管中消化也能好的啊，你要是在培养皿里消化要盖盖啊，不然很容易污染啊。
$ d9 p- J) K  g* j- T4 T1 j筛网用国产的200目的就行啊，那种筛子或者直接买筛网更省钱

老姜

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7 `% M# H% H$ I  k7 o- p: v' }8 s
  h9 e2 R# {8 Y& I& s/ ^你将你的Email告诉我，我直接通过馆际互借发到你那。

湖南干细胞

回复 wujh1986 的帖子2 L0 B0 K$ j  }
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哦，好的。我下次一定加盖。