酶消化法养脐带间充质，求助大神们

湖南干细胞

我用酶消化法，SIGMA的0.1%二型胶原酶消化了在培养箱里12小时，消化效果很不好。
+ p. p/ o$ Q9 ^( f/ s' c4 o- U放在培养皿（没加盖）里的2份脐带，一份还有组织块没消化干净，一份消化成很粘稠、没什么组织块，（用PBS稀释，消化后的上清液还是自动沉降下来），用50ml离心管消化的没有消化干净，还有很多组织块。离心洗涤后
' D& S" a2 w: _我考虑一下原因：1、消化时间太长，2、剥膜不干净，第一次剥膜；3、组织基本上没有剪成1mm3的；$ R0 q8 I4 M) |7 ^5 Q3 x
4、离心参数：（因为没过筛，所以离心了3次）。PBS稀释，1500 转/分，5min 1次去组织块，留上清；2500 转/分，5min 2次，洗涤胶原酶。最后很少有细胞沉淀下来。请教以上过程还有什么不对的？有没有改进的方法。

老姜

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  }& z! O+ S0 N  d9 \* l4 X; w3 T% d8 `6 R
你一定要用酶消化法吗？有些文献更支持用脐带Wharton' jelly组织块发直接培养效果不错，减少了酶消法对细胞的损伤作用。我是用脐带组织块直接剪碎培养，组织块法培养原代收获细胞的周期长于酶消法，但细胞不会受到酶的损害作用。一般培养15-20天就收获原代细胞。在此我给你推荐一篇我阅过的文献，以期对你的研究有所帮助。
7 c8 y0 i9 S$ i- F! @- C( S5 r4 \A rapid, simple and reproducible method for the isolation of mesenchymal stromal cells from Wharton’s jelly without enzymatic treatment. De Bruyn Cécile, Najar Mehdi, Raicevic Gordana; K* b! A0 p5 Z7 ~$ ~7 j# B) y' B
et al.Stem Cells Dev        2011;20(3):547-557 doi: 10.1089/scd.2010.0260  g  J# \! @) `; [3 r

1 ?0 z" R. D* c8 P7 r                               
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wujh1986

1.消化时间并不是很长啊，如果你将组织剪得足够碎，这么长时间后只会剩一点点小小的组织块。
+ e; ]1 T, p$ o2.外膜本很难完全剥离的，尽量剥除，剥不完也没关系的啊。( n2 [: p2 [: C2 C1 }  K5 P6 K
3.过筛后离心会将组织块除去啊，第一次转数可以提高，时间延长。第二次可以降低，要求大量稀释就好啊，能将剩余酶洗净的。( M3 s  Q% L& B* z
4.离心完的细胞是很难在镜下计数的

湖南干细胞

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2 q1 R/ m& t; F9 f
; i6 \3 S1 q$ g4 N# b$ \8 h2种方法都在试。我这里网络有问题，现在进了很多数据库都进不去，你能把文章传上来看看不？谢谢。我

pailishi

用酶法也很好的，效率也很高

湖南干细胞

回复 wujh1986 的帖子; e" V# a( W* J4 Y
( E( F6 y( b  @4 O. E8 S7 ?0 z; i
消化的时候，用培养皿要不要加盖？培养皿效果好还是50ml离心管效果好？我的培养皿消化完后里边的细胞很多。用那个牌子的筛网效果好？

莫邪小仙

用脐带组织块贴壁爬片法比酶消化法效果要好很多。将脐带清洗剪碎，将碎块置于培养瓶中，过上一段时间就紧密的贴在瓶子上了，然后再加培养液就ok了。长出的细胞很纯，状态也好。

wujh1986

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: E0 Q7 L+ t: E3 d5 y, v9 V, `9 D5 K1 m( ~7 O/ w) L$ J
其实消化最好是在那种能摇动的培养箱中，但是仪器很难那么齐全，可以剪碎后，分成两三管在50ml离心管中消化也能好的啊，你要是在培养皿里消化要盖盖啊，不然很容易污染啊。- e: V. y7 l  q. h# d' J  D
筛网用国产的200目的就行啊，那种筛子或者直接买筛网更省钱

老姜

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+ F' g7 e) q  Y% Y, o5 v5 a& }6 s8 h- U# ?& K
你将你的Email告诉我，我直接通过馆际互借发到你那。

湖南干细胞

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8 P& a& ^: Z/ ~1 y" G. s
  ^* H/ W4 T9 b, L; q: A哦，好的。我下次一定加盖。