免疫荧光二抗用什么稀释？

xiaoyurly

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! ?+ _& C) P1 H7 |, l& k
6 \, t8 _3 Y8 v4 x我们图省事一直用PBS稀释，效果也都不错。1 B1 l0 Y; b! w5 y9 p+ }
不知你说的效果不好指的是哪方面，背景高还是特异性差？
+ \6 E: R$ r% S! A免疫染色效果不好不能一味怪在二抗身上，很多因素，比如封闭、是否需要抗原修复、抗体浓度、作用时间等等

xiaoyurly

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+ s4 L: C- L3 a9 x" V荧光染色不用H2O2处理' `% \; v  @' d
一抗是什么？胞内抗原染色需要Triton破膜处理的
- f4 [# }' @5 [  Z# Y; A8 N抗体作用终浓度在2-5ug/ml即可，酌情稀释抗体( B) g! T3 Y1 G% p+ O1 a% S9 {

. f" h8 }( w' [; c私认为一抗4℃过夜效果较好，血清封闭在30-35min

xiaoyurly

回复 请叫我晓白 的帖子3 \- w# a* ]0 X' e; r9 w7 T
" s' K2 }% i7 r' ]' P7 r  G5 U
是这个意思，再尝试一下吧，免疫染色有时候确实难出，加油

xiaoyurly

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* N2 C8 q) C% z' G3 a
9 [. L* ~" G5 z( T. G7 P4 n' ~c-kit染色确实不必破膜的，我们以前也做过大鼠冰冻切片但是效果不尽如人意，后来用了石蜡切片经过抗原修复才出的结果，而且我们是用santa的抗体都能出（1:100），荧光染色我们从不用H2O2处理，可以上一张图片给你看下，心肌切片

xiaoyurly

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/ ~: B# {" V2 {' \" {石蜡切片常规脱蜡复水，柠檬酸缓冲液热修复，88-96℃ 15-20min，冷却1h后PBS洗一次，羊血清（原液以1:20比例用PBS稀释）封闭室温30min，一抗1:100溶于含羊血清1%的PBS中，4℃过夜；转天取出复温1h左右，PBS洗5min×4次，对应荧光二抗孵育，4℃ 4h or室温1h，PBS洗4次，封片镜检

xiaoyurly

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) v. y  h2 ~4 v5 S5 E4 B
! r1 W) @$ ^$ M* }0 `  O* u染冰冻的确实少，但是抗体说明书上明确表示可以用于冰冻切片染色，我们染不出来才换成石蜡，成功率才高了的。' @2 D; ?( s1 J& O8 V
我们做的是心脏切片染色，心梗后5天的组织切片，还在炎症反应期间，所以c-kit阳性细胞较多，常规荧光显微镜拍摄。现在用共聚焦的挺多，照片清晰度更高。如果是正常心脏固有的c-kit阳性细胞应该是比较少，你是想染心肌干细胞吗？可能需要大量切片染色，然后耐心找视野: P: i) M5 e2 R

xiaoyurly

回复 请叫我晓白 的帖子# _+ Z' q! u9 A/ O0 ]: u* E$ `& ]! g& W
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没问题，祝好运

xiaoyurly

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8 G2 Q1 j7 Z! @4 g我看不到图片
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xiaoyurly

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& P- X* T4 ]) I. S! m; u2 J8 P, A9 g
这次看到了，不错，看着挺像阳性染色的，应该是了

xiaoyurly

回复 请叫我晓白 的帖子0 X4 \5 J1 U8 Q) D/ @
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细胞核没有问题，心肌细胞的细胞核确实挺密的