电转试剂盒LONZA以及电转细胞与质粒比

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回复 hjd8886 的帖子
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1 B% j8 c* ~/ G前几个问题，您去他的网站上查查，都有。9 B+ _1 R2 {# I3 I% `
“100万的细胞用30ug的质粒”个人感觉太多了，细胞受不了，会死很多。按照我的经验，100万细胞用3-4微克质粒即可，当然质粒的浓度最好在1ug/ml左右，仅仅是个人经验，仅供参考

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回复 hjd8886 的帖子6 _( q" b% F3 [! _

: \& ~4 e5 a3 W+ b( J再啰嗦一句，如果是要电转细胞，并且电转的细胞还要进行后期操作的话，最好是用区内毒素的试剂盒进行大提质粒

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回复 hjd8886 的帖子2 Z% o; x# ?- t2 h7 Q. U
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我用Lonza大概电转了将近1000次了，针对您的问题给你点儿小建议：1  100万的细胞用4ug质粒，点击液100ul的体系最佳，点击液注意4℃保存。2  电转仪报错，转盘很快的就转回来，就是电转没有成功，必须重新电击，不然的话是不起作用的。这里面有几个原因：一个是细胞量太大造成的；一个是质粒量太大造成的；一个是电转程序不对造成的，一个是电击杯中有气泡造成的。3   针对您“直接转移到10cm盘培养，但是没有及时摇匀，好多细胞都贴壁了”的问题，在电转完成后，应该先将电击的细胞马上转入培养基中（培养基根据所要铺板的多少，应提前准备在15或者是50ml离心管中），再用移液器混匀，铺板，问题就解决了

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回复 刘明东 的帖子
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6 d6 d4 e0 G# s  J0 {  C- F+ {不好意思刘同学，我的QQ是经常不上的，有什么问题您直接在这里讲就中，本人保证知无不言言无不尽，相互交流共同提高

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回复 sirius_zou 的帖子, w0 C. g( Y$ ]* p; B1 L% O, c

, @6 M! B2 W" O0 r# h5 R电转悬浮的细胞和贴壁的成纤维细胞之间并无太大差别，不过每种细胞因为他们的直径大小，细胞膜厚度以及承受电容的不同，需要进行一定的程序摸索（LONZA网站上提供的只是参考电转参数），一般的来说，电转后死亡10-30%，属于正常死亡。电转100万个细胞用100ul的电击液和4ug的质粒就足够了，多了反而会造成细胞的死亡，质粒最好是大提的（去内毒素）。我之前电转过鸡的悬浮淋巴细胞，电转参数为B013，效率还是蛮高的，仅供参考。如果是第二天加药物筛选的话，2天后死亡一半还是比较正常的，当然这也和你的电转质粒的整合率和表达情况是相关的。所以，假如您应该先摸电转程序和适合的电击液，后电转pMAX-GFP（自带）质粒，统计电转效率，再做定夺。

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我用过Amaxa NucleofectorⅡ型的，你的250微升-210微升细胞（约1000万个细胞）-40微升质粒（40微克）体系，确实有点儿过，这个体系最好是200ul点击液，200万-400万细胞量，8-10ug质粒。电击液直接用培养液，电转效率肯定大打折扣。但如你若说细胞出现大量死亡的现象唯一可以解释的就是你的电转程序不对，在Amaxa NucleofectorⅡ中是没有一个固定的电转程序的，对于不同的细胞需要在几个候选的程序中就行pMAX-GFP质粒的摸索，最后才能确定最佳的电转程序。电击液是LONZA公司赚钱的主要来源，我等P民是不会摸索出来的，如果你有效价比能媲美原装电击液的东西的话，那只能说，你去开公司吧，定能赚的盆满钵满。另外我之前做过一个鸡的淋巴悬浮细胞的电转实验，电转程序用的是B013，电转效率最起码在一半以上，仅供参考

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回复 刘金莹 的帖子% E  c* S% \4 p2 m+ k% C
2 p( I: R. l1 o# k! {" ]
真是对不起，真没电转过神经干，不过电转程序可以参考lonza网站

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回复 royltc 的帖子+ |/ R" O; R9 w0 f2 _& O2 g  p: {

/ J/ j. b7 l2 t/ _% p" I是一些细胞碎片之类的东西，有可能你还得多摸索几个转染程序