小鼠骨髓密度梯度离心 FCM结果

dyg108

为得到小鼠骨髓单个核细胞，选用ficoll 1.077密度梯度离心。小鼠骨髓细胞以PBS（4 ml）悬浮，ficoll 4 ml，400 g，20 min离心。结束后白膜层明显，PBS悬浮细胞4 ℃过夜后染DAPI，FCM分析，结果如图：
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2013-5-9 13:10 上传

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请教，第一张图红色部分是什么细胞？为什么没染上色？
9 H% E8 ^* D: N. Q  P" u% _3 j又取来ficoll底部的细胞，DAPI染色，FCM结果如图. N* O) K5 |5 @" F, e+ z

2013-5-9 13:14 上传

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2 S1 p/ L- ~" O* H8 i9 y; I这个更是困惑了，请教大虾们

katysong

1. 其实DAPI不是一种严格的区分活死细胞的染料，如果DAPI足量的话，活细胞核也会着色，表现为弱阳性；若是要区分活死细胞，建议可以试一下7-AAD。
/ a1 |9 k/ O+ c) H% N& |2. 这次实验DAPI的电压是怎么调整的，怎样确定的阳性和阴性，有没有绝对阴性？' K: e+ e* g' {& I) Y$ F- y* G
3. 002中第一张图，红色部分细胞那么大应该是单核吧，是属于DAPI弱阳性还是DAPI拒染还真说不清楚；
$ x1 ]& m* G  ]- e. V2 c; Z4. ficoll底部应该大部分是红细胞，还有部分粒细胞，红细胞没有核不会被染上，但那部分绿色的确实很奇怪，绝大部分又不是粒细胞，看还有没有哪位高手可以指点一下。
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dyg108

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7 h& P+ E2 F7 ?
! |: E$ n- N- J) t* \7 l% p" A非常感谢，DAPI电压是以没有DAPI染色的细胞调的。
4 a; S; C& q" i0 [8 u

lyj-0017

回复 dyg108 的帖子5 p5 ]% |# U2 x- P- [, |
- W. K4 T) A, k& q9 K
      小鼠单个核细胞的分离常用密度为1.092的小鼠淋巴细胞分离液进行分离，而分离人单个核细胞常用密度为1.077的人淋巴细胞分离液。我认为是你用的淋巴细胞分离液的问题，分离液密度不适应，所以分离出的细胞分层也不同。
6 L2 O& U2 ?; V2 L: E    另外，你小鼠骨髓细胞悬液与ficoll的体积比是1:1，而常用的外周血或者骨髓细胞悬液与ficoll的比例是2:1，也许这也是一个导致细胞分层不正确的一个因素。