Science：可重组性的遗传逻辑门

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Science：可重组性的遗传逻辑门0 ^/ {0 H& M5 P& {$ k; {8 V0 K, N# }
2013-05-13 来源：lifeomics 作者：邓棋霏- a. U- G/ A) d) W8 k' `5 H/ P- `
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利用序列倒置（sequence inversion）的原理，使两种输入信号的所有16个可能性逻辑门全都能被细菌细胞所识别。
, q3 Y: ]% Z; e' \2 n# s+ ~7 [( \说起逻辑门（logic gate），人们首先会联想起电路板，但是细胞也同样非常依赖于逻辑计算（logic computations）。一个典型的例子是乳糖操纵子（Lac operon），它能够在“乳糖与非葡萄糖（lactose AND NOT glucose）”的逻辑运算下自我激活。最近几年已经有多项研究详细报道了活细胞内的、经合理设计的基因编码性逻辑门与逻辑回路。正如乳糖操纵子那样，这些逻辑门接收了两种或两种以上的分子信号（输入），并生成一种信号（输出），且输出信号水平与输入信号水平之间有逻辑关系。在这两种输入信号与一种输出信号之间可能存在有十六种不同的逻辑联系，但是目前仍难以对大部分的这些联系进行合理设计。由于这些逻辑门存在复杂性，因此有关输入信号的综述通常不会提及输入信号的确切值，例如不会提到“两种输入信号是相同的”（XNOR门）或“两种输入信号是不同的”（XOR门）。目前有两项研究描述了通过稍微调整逻辑门的基因构件，从而以非常紧凑的方式形成这16种逻辑门（包括众所周知的XNOR门与XOR门）的方法。在这两项研究中，一项由Bonnet等人完成并发表在本期期刊第599页，另一项研究由 Piro Siuti 等人完成。* p0 M# V4 `: A
最近发生了一场争论，即一些调控性逻辑门的自然进化比其它逻辑门要困难得多。这场争论反映了人造逻辑门技术的不均衡性进展。事实的确如此，Bonnet等人与Siuti等人所用到的构建方法的成功关键来自于改变噬菌体衍生的分子工具的用途，这些分子工具所扮演的自然角色不再是调控基因表达，而是将噬菌体DNA插入到宿主基因组（位点特异性丝氨酸重组酶（site-specific serine recombinases），或整合酶（integrases））中。整合酶能够识别一对彼此不同的特异性序列，称为attP（在噬菌体上）与attB（在宿主中）；attP与attB在重组和插入噬菌体后，就会转化成一对被称为attL与attR的位点，从而不再是重组酶的底物了。利用attP与attB位点，刻意地构造一个改造后的DNA序列，就能够“欺骗”重组酶，使其将这个DNA序列进行不可逆性的反转。这种“不可逆性”并不是全部的原因；当另外还存在一种名为重组定向性因子（recombination directionality factor, RDF）的蛋白时，整合酶能够识别attL与attR序列。5 j# N. @( z: {; R( W4 N6 V1 h
利用重组酶来调控基因表达，这在自然界中并不是稀罕事：fimB/E重组酶能够翻转可调节大肠杆菌（Escherichia coli）致病性的启动子。在基因工程中，重组酶通常被用于对DNA序列进行插入、切除或倒置，从而形成结构良好的基因表达单位，或形成不能进行基因表达的变异体。最近的研究中所用到的装置是专用于进行序列倒置的，这是因为其潜在的生化过程是高效率的，并且能够被RDF选择性地逆转。目前的主要进展是，当多种酶具有一定活性模式来形成转录活跃性构造时，就能够用一种以上的重组酶来控制同一个基因。在这种方法的基础上，再对特异性重组酶底物进行合理设计，就能够形成长久以来一直探寻的多样性逻辑运算。& I7 g7 r; @4 h% g" o
Siuti等人所构建的逻辑门能够翻转基因启动子、转录终止子与基因编码序列。Bonnet等人在大多数情况下用的是终止子，偶尔也会用到启动子。例如，他们将一个终止子放在基因编码序列的上游，然后用两种不同整合酶的两对嵌套性attP/attB位点将终止子包围起来，最终构建出了XOR逻辑门。如果其中一种酶处于活性状态，那么终止子就会向后翻转，并离开编码区域，从而使转录过程得以继续进行。但如果两种酶均处于活化状态，那么终止子仅翻转一次，然后就会重新回到它的转录阻断位置上（下图）。而Siuti等人的研究所用的是一种类似的嵌套结构，但是他们用的是启动子，而不是终止子。当两种整合酶中仅有一种酶发挥作用时，朝向后方的启动子将恢复为正确的方向，但是当另一种酶也发挥作用时，启动子的方向将又回到原来的状态。' Z! y  Y- h6 I! o4 s$ g8 }' g1 T
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转录信号的调控。改良后的逻辑门能够调控细菌细胞中的转录过程。我们用一副卡通画来说明Bonnet等人创建XOR门所采用的方法，我们将RNA聚合酶比喻成卡通画中等待前进信号的火车头。如果TP901与Bxb1这两种重组酶均无活性，转录终止子序列将阻止转录过程的进行（左上图）；当TP901与Bxb1都有活性时，有效地抵消了彼此的作用，转录终止子也将阻断转录过程（右上图）。当两种重组酶中只有一种酶有活性时（下图），终止子序列被倒置，RNA可继续合成，从而向转录过程发出了前进信号。
, y, x2 M8 k8 M较早期的研究工作所构建的可逆性输入-输出交互作用能够使输出信号动态地追踪不断变化的输入信号。然而由于DNA修饰具有不可逆性，因此以重组酶为基础的逻辑门不同于这些早期工作。在新装置中，由于整合酶的输入信号能对输出DNA进行不可逆性修饰，因此逻辑条件比简单的“此时此地”更加复杂。因此，如果AND逻辑门的两种输入信号在通过门时（未必在同一时间通过）均处于活性状态的话，AND逻辑门就会生成输出信号。历史依赖型逻辑运算将调用密切相关的时序逻辑（sequential logic）概念与有限状态机（finitestate machine）概念。后者可被描述为一个拥有输入接收器的存储单元。该单元可储存一个信息片段，即状态（state），当输入信号到达时，状态可以随之发生改变。大量的研究已经明确地探索了将重组酶作为状态机和计数器的工具的可能性，并且通过双向重组程序（bidirectional recombination process），就可以在较早地实现可重写性存储单元。! N4 W- B" t9 S3 h6 B5 Q8 t
整合酶方法使真正意义上的数字逻辑成为可能。在较早期的研究工作中，由可逆性输入信号，例如转录因子或微小RNA（microRNA）所调控的基因能够被完全诱导或完全抑制，但是同时也会出现中等量的表达水平。被整合酶调控的单个基因只能以有限数量的状态存在，除非经过其它明确的调整，否则该基因只能被完全地激活或完全失活。被报道的试验采用的是多拷贝质粒，每个细菌的输出信号水平能够反映细胞内不同质粒状态的比例，因此输出信号存在极大的异质性。然而，研究者们通过使用单个拷贝的质粒或稳定性染色体整合技术（stable chromosomal integration），进行细致的单细胞测量，从而证实每个质粒只能以完全打开状态或完全关闭状态的形式存在。9 ^; {5 n! O6 Z! I& x2 B
整合酶究竟是如何在单细胞、单基因水平上影响输出信号的？这是一个悬而未决的问题。在两项研究中，整合酶均受到可诱导性启动子的调控，而并没有对每个细胞的输入信号，例如通过荧光信号融合技术（fluorescent fusion）和输出信号进行同步观测。这些测量是非常重要的，因为从原则上而言，即便整合酶含量非常少，但是只要有足够的时间，就能够诱发信号转换，并使逻辑门极度敏感。Bonnet等人朝着这一特性迈出了极其重要的第一步。他们用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein）来替代整合酶，间接地对整合酶进行了定量，并推测出整合酶与输出信号之间的平均关联程度。他们观察到，当给予低水平的整合酶时，信号发生衰减；当给予中等量的整合酶时，信号出现了放大。这两种情况均是数字信号处理过程中所需要的特性。
' U7 F" Q) f; h6 g重组酶逻辑门是合成电路设计中的一个新范例。Bonnet等人与Siuti等人所报道的实验系统将逻辑、存储、复位输入（input reset）和数字化状态进行了整合，因此成为了生物网络理论的非常有趣的测试案例。这些逻辑门可能与任何天然的逻辑门相差最大，因此合成与系统生物学家可能在未来几年内会对此进行细致研究。* q+ A" s9 X  |, F8 \
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: c+ \7 c# c# [& p原文检索：0 J  s+ L( O. g. L% A
Yaakov Benenson. Recombinatorial Logic. Science 3 May 2013; DOI: 10.1126/science.1237738
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•        期刊SCIENCE2 a: Y4 x. B! U5 o
•        研究机构INTERNATIONAL OPEN FACILITY ADVANCING BIOTECHNOLOGYSTANFORD UNIVERSITY
' i9 ^: [/ s3 W. V•        标签SCIENCE可重组性遗传逻辑门逻辑门
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: T1 v1 E2 ]+ r, I2 x4 D& ]beautiful work!
+ T/ k9 _. i% y$ i% h' P如果能应用computer engineering 来调控细胞的遗传过程，或输入设定好的算法，将会孕育出一些崭新的技术。
: C+ b* }  y1 W4 n8 g5 O. E7 e不过，这些逻辑算法是否能全面地体现真实的遗传过程，如何减小逻辑计算和真实遗传环境的差别恐怕值得思考。
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1 S1 Y# h7 K0 l/ @$ G  D1 ?" pFig. 1 Using transcriptors to implement three-terminal Boolean integrase logic gates.6 Q4 F# m6 ]3 k; }2 Y  R8 N5 H
(A) Three-terminal transcriptor-based gates use integrase (Int) control signals to modulate RNA polymerase (RNA Pol) flow between a separate gate input and output. (B) A canonical transcriptor element wherein an asymmetric transcription terminator (T) blocks transcriptional current in one orientation (red) or, when flipped, the opposite orientation (gray). Opposing recombination sites (black/white triangles) flank the terminator and direct flipping by an integrase. (C) Integrases can also excise DNA between aligned recombination sites. (D) State diagram for a transcriptor “exclusive or” (XOR) logic element: Opposing sites recognized by two independent integrases (blue/orange and black/white) are nested and flank one terminator. Recombination can produce four distinct states controlling terminator orientation. (E) The logic element from (D) within a three-terminal Boolean integrase XOR gate such that gate output is high only if control signals are different.

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谢谢！