G418筛选细胞，为什mRNA水平和蛋白水平不一致呢？很是郁闷

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# r, Y3 A' L$ j" N$ f) L2 I: A首先关于不一致的问题我的理解有两种：一是RT-PCR可能就有误差，最好进行三次独立的实验。二是假如你设计的引物是针对目的基因的，RT检测的是外源加内源，蛋白检测的是外源的  这个会出现不一致的情况。还有假如你用的标签在载体上，目的基因比较小，也有可能出现对照中都有的情况吧 ，你对照中出现的条带位置与实验组一样么？2 H% ?9 @( o) D9 Z6 k

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  \5 [4 f' s2 [我有点迷糊，你做得是原核表达？

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# V6 D3 s1 X: j7 y, E# H
& N8 h1 R  |7 D确实很棘手，我也被搞迷惑了。

yangcy-smile

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8 ^. A9 X6 L8 N$ o" H' Q5 _我师弟在建细胞系的时候遇到过这种情况，他也是筛到最后细胞成了克隆，怎么筛也不死，但是并不都是阳性克隆。我觉得首先确定自己构建的质粒绝对正确，没有空载体的存在。然后转染建稳转时拿什么都不转的细胞来做阴性对照，只是在筛之前对转有质粒和空载体的平行细胞组进行检测，看是否表达，然后确定表达后再对平行转染质粒和没转染的用以前摸索好的G418浓度进行筛选，基本达到阴性全部死亡，阳性克隆存留，这样再对建成的稳转细胞系进行RT或者Western检测时用没转染的细胞做阴性对照即可。一点拙见，可能帮不上忙。