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发表于 2013-6-30 18:03 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

本帖最后由细胞海洋于 2013-7-2 10:48 编辑

Nature：全览细胞培养技术最新前沿( r* ]5 H4 R6 q; D
2013-06-30 来源：lifeomics 作者：筱玥

科研人员新近发明了一种三维立体细胞培养技术，这种培养条件可以模拟天然的组织环境，让细胞在更接近于自然的状态下生长。
细胞培养技术的进步意味着科学家们对细胞培养基的成分有了更深入的了解和认识，让细胞有一个更加天然的生长环境，即便在实验室里也不例外。
因为细胞可以在实验室条件下生长和培养，这让科学家们的科研工作容易了许多，所以科研人员都希望细胞能够在实验室里更好地生长下去；同样的道理，如果科研人员不能提供一个适宜细胞生长的环境，那么他们的科学研究工作就会遇到障碍。" v, q" [$ B" F+ B
因此，细胞培养基（culture media）市场是一个非常活跃的市场，科研人员希望在实验室里培养各种细胞，所以市面上也就出现了各个试剂生产厂家提供的各种各样的细胞培养基商品，甚至还有一些“独家秘方”产品出售，这些产品为实验室里培养的各种细胞提供了充足的“口粮”。不过细胞培养工作更依赖经验的积累，所以培养细胞更像是一门艺术，而不是一种高度可重复的科学，很难通过一套方法或者理论选择出合适的培养基。
细胞培养基上的即便极其细微的差别都会对细胞的生长带来明显的影响，但是具体的原因现在还不清楚。所以很多科研工作者在培养细胞时都会使用自己的“独家秘方”，但这样做就违背了科学的基本准则——可重复性原则。英国伦敦大学学院（University College London）的试验病理学家，同时也是多本有关动物细胞及人类细胞培养学术专著编委之一的 John Masters 就认为，这种“独家秘方” 式的培养基是很难重复的，因为即便是同一个人配制的独家培养基，各批次之间也会因为配方各成分的绝对含量有所不同而出现差异，而且从不同的供应商那里买来的各配方组分，或者是采自同一家供应商，但是不同批次的各配方组分的纯度和含量也都会出现偏差。而且我们都知道，在配制少量化学混合溶液时是最容易出现各批次产品的质量不均一的情况的。( R) q, v: O  M( q
不过随着对培养基成分的重要性有了不断深入的认识，科学家们也越来越意识到这个问题的重要性，对培养基成分的标准也正变得越来越严格。比如有一些科研人员就正在尝试彻底去除培养基中的动物来源组份，因为他们担心它们会“污染”或者影响应用于临床治疗的细胞系产品。还有一些科研人员则正在努力通过人工培养技术模拟出天然细胞的生长环境，比如我们下面将要介绍的三维立体细胞培养技术（three-dimensional tissue structures, 3D tissue structures）。1 n( G& |/ T  M1 h
有很多细胞是不能（很难）在实验室里培养的
细胞培养技术非常重要，这一点在正蓬勃发展的诱导多潜能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）研究领域显得更加突出。使用这种干细胞技术可以将成体已分化细胞（adult cell）的分子时钟往回拨，让它们倒回到最初的状态，即未分化之前的状态，这样，这些已分化的细胞就又可以进行新一轮的分化，形成各种终末细胞。这项新技术对于再生医学（regenerative medicine）领域意义重大，我们可以用这项技术在实验室里重新培养出各种“新鲜的”组织，用于治疗组织受损的患者。' {) ?; x9 V* m
比如日本神户的 RIKEN 发育生物学研究中心（ RIKEN Center for Developmental Biology in Kobe, Japan）的眼科学研究专家 Masayo Takahashi 就正在申请开展全球首例基于诱导多潜能干细胞技术的临床治疗试验，他将用这项技术对老年黄斑变性（age-related macular degeneration）患者进行治疗。我们知道老年黄斑变性这种疾病会让患者的视网膜（retina）坏死， Takahashi 的治疗策略就是对患者自身的皮肤细胞进行重编程（reprogrammed）操作，然后用得到的新生视网膜组织替换患者眼内已经坏死的视网膜组织。
与此同时，世界上还有一群科学家在尝试另外一个方向，这就是转分化（transdifferentiation）技术，即通过遗传学方法让一种已分化细胞转变成另外一种已分化细胞的方法，这种方法和诱导多潜能干细胞方法相比，省掉了中间的干细胞环节。其中最具代表性的工作就是由美国马萨诸塞州坎布里奇白头生物医学研究所（Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge, Massachusetts）的 Rudolf Jaenisch 和 Yosef Buganim 开展的工作。Jaenisch 等人利用细胞培养技术将结缔组织细胞（connective-tissue cell）转化成了能够表达 Sertoli 细胞（这是一种主要见于睾丸组织的细胞）特征标志物的细胞。这一研究成果有助于我们了解男性不育症的发病机制，也可以帮助我们开发出新的细胞培养技术，让以往不能，或者很难在实验室里进行培养的细胞走进科学家们的培养箱。! }* y0 t3 a) X; Q
Buganim 表示，培养条件能够决定培养细胞的命运。因为转分化细胞、诱导多潜能干细胞或者体外培养的神经元细胞，每一种细胞都有自己特定的需求，所以也需要给予不同的培养基和培养条件。比如每一种细胞需要的生长因子不一样，有的细胞可能需要这一种生长因子；有的细胞又不能给那一种生长因子；有的细胞需要较高浓度的氧；有的细胞则需要较低浓度的氧，这些因素都会影响到细胞的正常状态和特性。
不过据美国威斯康辛州麦迪逊市 Primorigen 生物科技公司（ Primorigen Biosciences in Madison, Wisconsin）的技术及市场开发部经理BradleyGarcia介绍，干细胞研究人员更加需要的是能够维持干细胞生长，并且诱导干细胞定向发育、分化的培养基和培养技术。 Primorigen 生物科技公司的主要业务就是开发并销售这一类的产品。如果培养基能满足细胞的要求，那么分化的干细胞—— 无论是干细胞、心脏细胞还是神经细胞，都有可能在培养基中生存数天、数月甚至一年以上。& X" F+ v2 f, Q/ W. N
细胞的生长是不可预测的，它们在这一种培养基里的生长速度可能要比在那一种培养基里快很多，但是没人知道这是为什么。而且据 Primorigen 生物科技公司产品开发部的高级经理 Scott Monsma 介绍，干细胞在这方面的表现更加突出，它们会对不同的培养条件（比如培养操作不精细、细胞生长太密或者存在应激刺激等）做出反应，进而发生相应的分化。由于存在这些因素，所以开发干细胞培养基非常困难，但是这方面的市场需求却相当大，因为干细胞在医疗上的应用潜力是无限的。
少而精的培养基
还有一些科研人员使用供给培养系统（feeder-based system）进行干细胞培养。在这套培养系统里会使用一些支持细胞（supporting cell），比如小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast）等，让这些细胞分泌生长因子供人工培养的干细胞使用。但是据销售干细胞培养基的加拿大温哥华英属哥伦比亚肿瘤研究所附属干细胞技术研发中心（research and development at Stem cell Technologies, aspin-off from the British Columbia Cancer Agency that is based in Vancouver, Canada）的资深科学家 Erik Hadley 介绍，这种方法非常容易出问题。这不仅仅是因为每一批支持细胞会有所不同，而且很难控制由这些支持细胞分泌的生长因子的数量以及生长因子分泌的时机，所以也就无从谈起哪一些生长因子（培养成分）才是干细胞进行某种分化时必需的了。
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Glauco Souza 开发出了一种能够模拟体内环境和蛋白质分泌情况的微组织（microtissues）细胞培养技术。
为了解决这个问题，干细胞技术研发中心专门开发了一种不含供给细胞的干细胞维持培养基（feeder-free stem-cell maintenance medium），这就是市面上销售的 mTeSR1 培养基。此后开发的第二代产品 TeSR2 培养基更是完全不含任何的动物来源蛋白。在 2013 年 1 月新推出的 TeSR-E8 培养基则只含有 8 种组份，这是根据美国威斯康星大学麦迪逊分校（University of Wisconsin - Madison）的干细胞研究专家 James Thomson 提供的专利配方开发的新产品。美国加利福尼亚州生命科技公司（Life Technologies in Carlsbad, California）也推出了一款同样的产品，他们称之为 Essential 8 Medium。% @. H, {( g" G$ ^) T" M
美国休斯敦得克萨斯大学健康科学中心（University of Texas Health Science Center in Houston）的干细胞研究专家 Mikhail Kolonin 认为，这种成分确定的培养基产品的出现终于让细胞培养操作走出了“炼丹”时代，也让细胞培养试验和临床应用结果更具可重复性。
不含动物成分的医药产品
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这是一幅经过艺术加工的肝癌细胞扫描电镜显微照片（scanning electron micrograph）。. C7 }$ _3 u0 s+ D/ P7 T8 i9 Z/ C
据 Monsma 介绍，供给培养系统除了存在上述这些问题之外，还有一个因素也是影响试验可重复性的拦路虎，那就是在干细胞培养基中常用的胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）中含有的生长因子、蛋白质和其它的营养成分。在干细胞培养基中，胎牛血清通常都达到了 20% 的比例。每一个批次的胎牛血清产品都来自不同的胎牛，所以它们的组份必然或多或少会存在一些差异。据 Kolonin 介绍，问题在于他们根本不知道这些组份出现了哪些改变。这也正是关注干细胞临床应用问题的干细胞研究者在使用含血清的培养基时格外谨慎的原因之一。
Kolonin 还介绍了另外一个原因，那就是使用含动物来源成份的培养基培养出来的细胞在应用于临床组织移植（tissue transplantation）时有诱发受体出现免疫排斥反应的风险。总部位于美国马萨诸塞州的 Thermo Fisher Scientific 公司（Thermo Fisher Scientiﬁc, headquartered in Waltham, Massachusetts）细胞培养及生物工艺业务部的产品经理 Nathan Allen 还提到了另外一种可能，那就是污染（Contamination），这也是一大风险，而且会带来更为严重的后果，比如疯牛病（mad cow disease）就是一个极好的例子。在英国爆发的变异型克雅氏病（variant Creutzfeldt-Jakob disease），即疯牛病就是因为人食用了被感染了疯牛病的牛肉制品污染的食物而导致的。! @. I, d, m5 a  \& h# `3 Y# p
美国食品与药品监督管理局（FDA）已经禁止医药产品供应商使用含动物来源物质的材料。这一禁令的出台也给临床前研究（preclinical research）带来了一定的影响，因为据 Thermo Fisher Scientiﬁc 公司产品开发部的 Roberta Morris 介绍，在开发新产品时，最理想的状态就是在新产品、新技术开发的初期，提前考虑今后进行大规模工业化生产的需要。
所以 Allen 认为，基于这个考虑，今后开发的细胞培养基新产品都应该是不含动物血清的产品。 Allen 的公司现在已经推出了好几款不含动物血清，以及不含任何动物来源成分的细胞培养基产品。但是要完全不含动物来源成分可不容易，这至少意味着需要重新进行大量的工作对培养基配方进行优化，而且这还会影响到后续的生产工艺，并且造成其它影响。
上述所有特质会使新产品的价格居高不下。去年秋天，美国密苏里州圣路易斯的 Sigma-Aldrich 公司（Sigma-Aldrichin St Louis, Missouri）启动了干细胞维持培养基产品的开发工作，这也是该公司推出的干细胞产品系列中的一个组成部分。据该公司的首席科学官 Dan Allison 介绍，虽然这种培养基并不是完全不含动物来源成分的培养基产品，而且其中的所有成分都是已知的，而且绝对不含任何的、在其它配方培养基中常见的粗制蛋白（crude protein）成分，比如血清提取物或者脑垂体提取物（pituitary extracts）等。这些产品都是专门为了满足旨在开发干细胞应用产品实验室的细胞培养需要，以及需要大量培养基的用户而开发的。$ i5 @  V8 |6 k  }$ s
Monsma 表示，仅仅使用化学试剂和非动物来源的原料来开发完全不含动物来源成分的细胞培养基产品，意味着需要使用由人体细胞或者细菌表达并纯化的蛋白原料，比如人体血清白蛋白或者各种重组生长因子等蛋白。他们公司和其他一些公司正在从事这方面的工作。比如 Primorigen 公司就正在与好几个大学的实验室合作，将一种促干细胞分化的培养基（differentiation medium）改造成不含动物来源成分的培养基新产品。
对于从事干细胞研究的科研工作者而言，培养基发生这种改变意味着他们的实验室里今后也将不再需要某些试验材料，比如小鼠胚胎成纤维细胞等支持细胞。另外，在实验室里还有一些传统的试验材料，比如用于覆盖细胞培养皿内表面的材料等也都是含有动物来源成分的。之前由美国新泽西州的Becton Dickinson 公司（Becton, Dickin sonof Frankl in Lakes, NewJersey，该公司已经在去年秋天被美国纽约的 Corning 公司收购）生产的 Matrigel 就是一种源自小鼠肿瘤组织的产品，它主要被用来覆盖细胞培养皿的内表面，提供一层供培养细胞生长的基质。美国密歇根大学安娜堡分校（University of Michigan in AnnArbor）的科研人员早就发现，虽然使用 Matrigel 可以帮助科研人员确定诱导多潜能干细胞需要哪些培养成分，但是如果培养的干细胞将来被应用于人体，那么 Matrigel 的动物来源属性，及其不稳定性都会成为一个大问题。
工业化生产的细胞培养基
还有一部分科研人员只喜欢使用他们自己配制的细胞培养基。据 Masters 介绍，这一部分人都是有丰富细胞培养经验的人，他们很清楚自己在干什么。1 c0 e8 M& d( S# A$ e" s
不过 Masters 也补充说：“但是在这群人中，绝大部分的人都只知其然而不知其所以然，而且他们对培养基的配制原理也不感兴趣，只关心培养基是否好用。”不过他们也想买到商品化的细胞培养基。现在已经有公司开始为这群人提供培养基订制服务。在接受《自然》（Nature）杂志采访的公司当中就有公司表示他们提供的产品要比科研人员自己配制的更好，因为从原材料的检测、储存和配制过程，他们都有更为严格的质量控制流程，而且整个生产过程也都是在更加严格、稳定的环境中进行的。
使用工业化生产的细胞培养基会更好。比如在实验室里，细胞都是低温保存在液氮里的，每个人使用的低温保存培养基（cryopreservation media）也都不一样，其中就包括自己配制的低温保存培养基。但是据Hadley介绍，这样保存的细胞在解冻时会损失很大一部分，这是从事细胞培养工作的科研人员面临的一大问题。3 G7 |3 E* V# I7 [$ Y+ i/ B/ y
不过 Thermo Fisher 公司在 2012 年底推出了一款不含血清，也不含动物来源成分的低温保存培养基产品 HyCryo（该产品主要用于普通细胞系细胞），以及另外一款专用于干细胞冻存的 HyCryo-STEM 产品。使用 HyCryo-STEM 可以极大地改善冻存干细胞解冻、复苏之后的复原速度。据 Thermo Fisher 公司的细胞培养专家 Cindy Neeley 介绍，过去科研人员在复苏神经干细胞时只有 10-20% 的细胞会存活，不论使用哪种冻存培养基，包括所谓的独家秘方培养基，基本上都不能解决这个问题。然而使用 HyCryo-STEM 之后，细胞复苏之后的存活比例就可以提高到 50-60%。
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干细胞一般都储存在 −196℃ 的液氮里，但是这种方法的复苏效率非常低。5 K5 G! R! a, X: I$ y- G2 b; a- s
改善细胞培养环境也意味着对细胞培养器皿进行改良。比如 Corning 公司的生物工程师Po Ki Yuen 就通过工程学方法新开发出了一款 96 孔细胞培养板，这种培养板能够为细胞提供营养，同时还可以去除细胞生长过程中产生的有毒废物，更神奇的是，这种培养板还可以在不使用外部泵的情况下自动更换培养基。据 Yuen 介绍，使用这种培养板不仅可以减少培养基每天的使用量，而且还可以最大限度地减少人工操作的次数，减少细胞污染的机会，除此之外，这种培养板还可以模拟人体内的体液流动运动，这也是以往实验室培养系统所不具备的一项功能。0 j8 k% G5 ^8 o6 n+ U9 K
Yuen 还介绍说，他是在和另外两位同事召开新产品开发研讨会时突然有了开发这种细胞培养板的灵感，让他想到可以利用装载不同液体量的培养孔孔壁之间的压力差。通过连接在培养孔之间的由纤维素膜（cellulose membrane）或滤纸构成的窄纸条，培养基就可以从液面较高的培养孔单向流动到液面较低的培养孔，直至最后所有孔的液面全都达成一致。据 Yuen 介绍，培养基在他们这种培养板里的流速是可以人为控制的，只需要控制相邻孔之间的液面差高度以及连接在孔之间的滤纸条的宽度和孔径就可以了。. `0 [* r, l. q
据 Corning 公司的产品开发经理 Brian Douglass 介绍，目前这种 96 孔板还没有推向市场，但是使用相同技术的 6 孔细胞培养板已经开始销售了。使用这种6孔培养板最长可以 72 小时不需要人工换液，对于科研人员来说，这就意味着他们可以轻轻松松地回家过周末了。
三维立体细胞培养技术
科学家们和生物技术公司还开发出了一种三维立体细胞培养技术，使用这种技术可以让细胞聚集生长，形成组织样结构，这样有助于细胞之间紧密连接，促进细胞之间的信息交流。使用这种三维立体细胞培养技术，干细胞可以生长成球形的胚状体结构（embryoidbodies），而这种结构正是干细胞分化发育过程中必经的一个阶段。! ]! V' ?% C7 K+ P, T& f
据 Neeley 介绍，这意味着使用这种三维立体细胞培养技术，细胞将不再与培养皿的表面接触，因为只要与培养皿的表面有接触，细胞就会附着在培养皿上，单层生长。 Thermo Fisher 公司也开发出了一系列的细胞培养皿和培养板产品，这些培养材料的表面都覆盖了一层聚苯乙烯（polystyrene）材料，这起到了降低细胞附着力的作用。我们还可以使用生长支架（Scaffolds）帮助细胞成团生长，但是一旦去除生长支架，细胞的立体结构就会随之垮掉，就好像帐篷被抽掉了支撑杆一样。而且这些生长支架会妨碍我们在显微镜下对细胞进行观察。& I. B1 {# Y7 a  O7 H4 U, H
为了满足科学家们对三维立体细胞培养技术的需要， Thermo Fisher 公司专门开发了一种名为 Nunclon Sphera 的细胞培养板。据 Neeley 介绍，使用他们这种 Nunclon Sphera 细胞培养板，细胞将不会貼附在培养板的表面，它们会聚集在一起，形成一种球状的三维立体结构。这样就可以很方便地使用移液管移取细胞，不需要对细胞进行消化，也就不会破坏细胞的三维立体结构。目前已经有客户正在对这种新型培养板进行测试（beta-testing）。* h" \1 d. e8 ?" E; Z
其它针对细胞培养板开展的改良工作则主要集中在对基础结构进行改造这个方向上。据美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学（Johns Hopkins University in Baltimore, Maryland）的生物学家 Ross Harrison 介绍，三维细胞培养技术其实可以追溯到100多年以前。 Harrison 就曾经在一滴悬浮的蛙淋巴液中培养过神经组织，而且还观察到了神经细胞生出的轴突（axon）。
目前瑞士一家名为 InSphero 的生物技术公司正在使用这种液滴技术开发细胞立体培养板产品，这种培养板还是会使用传统的聚苯乙烯材料，但是因为采用了全新的设计，所以能够达到让细胞立体生长的目的。据 InSphero 公司的创始人，之前就职于瑞士苏黎士大学（University of Zurich）的生物技术专家 Jens Kelm 介绍，在他和苏黎士大学的同事 Wolfgang Moritz 以及瑞士联邦理工学院（Swis sFederal Institute of Technology, ETH）的工程师 Jan Lichtenberg 拿出了原型产品之后，瑞士联邦理工学院于四年前在大学的产业孵化器里成立了这家 InSphero 公司。! y1 F/ p8 b8 T) @* q$ T$ k; G% v! d
InSphero 公司设计的这种培养板采用了类似于香槟酒杯的V型孔底的设计，这不同于其它培养板常用的圆底设计。据 Kelm 介绍，他们采用的这种设计让培养板的孔底变得比较平，所以培养基液滴里的细胞就可以沉积下来，聚集成球形生长。1 H, S4 ~5 D# ~, G- |! G
为了让细胞聚集成团，培养孔的开口也借鉴了窄口花瓶的方案进行了重新设计，这样可以让培养孔壁与移液管能够贴合得更加紧密。科研人员发现，培养孔壁与移液管之间的密闭接触可以让每一个培养孔里的细胞数量接近均等，这可以让科研人员在对不同孔之间的试验结果进行比较时更加准确、更有意义。据 Kelm 介绍，为了达成设计目标，他们先从移液管的枪头开始试验，他们先将枪头尖切掉，从上面滴入培养基液滴，然后观察液滴是如何滴下的。( P+ Q: m1 Q2 r
2011 年， InSphero 公司和美国马萨诸塞州的 Perkin Elmer 公司（ Perkin Elmer in Waltham, Massachusetts）达成了合作协议，那就是用 Perkin Elmer 公司生产的自动成像扫描设备直接对 InSphero 公司生产的细胞培养板进行观察和扫描， Perkin Elmer 公司生产的自动成像扫描设备是各大药厂的必备设备之一。这次合作让 InSphero 公司开发出了更多的产品，比如他们设计了一款可以直接形成球形肝脏微组织（liver microtissue）的培养板，制药公司使用这种培养板可以很方便地进行药物毒性筛查试验。
Kelm 认为他们的技术在国际上拥有更加广阔的市场空间。比如欧洲的法律就禁止在化妆品测试中用动物做实验，这样就创造了极大的市场需求，因为化妆品生产厂家需要大量的模型进行产品测试，体外培养的微组织就是一个很好的解决方案。制药企业和化工企业也需要进行细胞学试验检测他们产品的毒性。此外，能够培养干细胞的液滴培养技术（hanging-drop technology）还可以应用于医学应用领域。# E2 J- ~0 ~, I$ ~5 C. o
法国国家健康及医学研究所（French National Institute of Health and Medical Research, INSERM）的生物学家 Nadia Benkirane-Jessel 使用 InSphero 的产品对如何缩短患者的骨修复时间（骨再生时间）进行了研究。为了让骨细胞处于更利于生长的位置， Benkirane-Jessel 将骨细胞接种到了由纳米纤维组成的支架上，细胞在这种支架上形成了球形三维微组织结构，然后 Benkirane-Jessel 将这种组织球移植到了试验鼠体内。 Benkirane-Jessel 还打算用 InSphero 公司的技术为她自己成立的 Artios Nanomed 公司开发一款新产品，这款产品主要用于骨再生和软骨再生领域。

图中所示的是结肠癌细胞，诸如此类的很多细胞都可以在缺乏生长支架的情况下聚集生长，成为图中这种微组织（microtissues）结构。/ \# i( d" }" d: S3 H
细胞漂浮培养法  I! C& G3 H+ {' S4 f, m
还有一种三维立体细胞培养技术是由美国休斯敦市的 n3D Biosciences 公司开发的， n3D Biosciences 公司也是由学术科研机构成立的一家附属公司。据该公司的首席科学官，同时也是公司创始人之一的 Glauco Souza 介绍，使用他们的技术可以让培养的细胞漂浮在培养基里，聚集成团生长。他们首先会用公司
独家开发的纳米磁珠 NanoShuttle 对培养细胞进行修饰，这种 NanoShuttle 纳米磁珠上吸附着与多聚赖氨酸（polylysine）交联的金和铁的氧化物。然后，他们会将培养板放置在磁场中。“将培养板置于磁场环境之中，这些纳米磁珠就会悬浮起来，将细胞聚拢到一起。” Souza 介绍说。

n3D Biosciences 公司开发的最新细胞培养技术使用了纳米磁珠（magnetic nanoparticle），这些纳米磁珠可以在磁场的作用下悬浮起来，进而能够将培养皿里的细胞聚集到一起。
细胞之间的相互作用是促进细胞生长的重要因素之一，通过纳米磁珠使细胞悬浮起来可以增加细胞之间的相互作用，与传统的细胞培养方式相比，这种悬浮培养方式更接近体内的真实情况。而且使用这种培养板对细胞进行换液也会更方便，因为磁场可以吸住细胞组织块，不用担心在换液操作时被吸走。 Souza 继续介绍道。7 h: Z& |. D/ |. E% z
Souza 之前是在美国休斯敦市 MD Anderson 肿瘤研究中心（MD Anderson Cancer Center in Houston）工作的一名物理化学家，据他介绍，制药公司以及科研机构使用了他们开发的这种培养板之后都发现，培养出来的细胞组织微块（microtissues）不论是在外型上还是在蛋白表达水平上都更加接近体内的组织，所以用这种培养板培养出来的细胞组织是一种非常好的体外药物筛选组织模型。 n3D Biosciences 公司的细胞悬浮培养板已经打进了大学的实验室和制药公司，他们现在正在开发高通量药物毒性筛查设备，也有意从事药物开发方面的工作。0 n( y2 n7 L9 W9 A2 Q; E# H2 t
罗马真的一天就可以建成* e6 q6 B6 ]/ A
Kolonin 是 n3D Biosciences 公司的客户之一，他主要使用这项技术对脂肪组织开展研究，同时他也认为这项技术比较适合进行干细胞组织培养方面的工作。如果要在体外（培养皿中）再造一个组织，那么就需要提供组织中存在的所有类型的细胞，而且要让这些细胞彼此之间建立联系。可是在实验室里常用的扁平培养皿中，通常只能生长一种细胞，因为只有最适于在塑料表面和某种特定培养基环境中生存的细胞才能胜出，其它细胞都会慢慢死去。可是使用 n3D Biosciences 公司的培养板就不一样了。据 Kolonin 介绍，头一天晚上你把磁珠丢到细胞培养板里，第二天再把培养板放到磁场中，第三天你就会惊奇地发现长出了球状细胞团块（spheroid），这种细胞团块里就含有各种组织细胞。整个过程真的就需要一天时间。, p1 ^2 w4 e  b+ x' a
Kolonin 还补充说，这种磁场细胞悬浮培养方法非常适合脂肪组织的生长，也很适合干细胞的培养，用这种方法能够很好地保持干细胞的分化能力。8 W' x/ a  O5 c6 R- R$ `2 D# v) Q. M
不过这些纳米磁珠也有可能会对含有磁珠的细胞带来不好的影响，但那是比较罕见的情况，在培养的细胞中只有少部分细胞会受到影响。而且细胞组织微块会紧密地团结在一起，保持团块状结构，含有磁珠的细胞也会“吐出”磁珠，这些磁珠又会进入到培养基中，继续发挥作用。
美国布朗大学（Brown University in Providence, RhodeIsland）的生物工程师 Jeffrey Morgan 评价道：“我们对细胞三维培养这项技术反应太迟钝了，不过我相信大家很快就会接受这款新产品，并且对其做出中肯的评价。” Morgan 认为，细胞彼此接触之后就会彼此发生相互作用，并且进行信息传递，这一点是人工生长支架无法提供，也无法满足的，所以使用这种悬浮培养技术可以让细胞在更接近体内真实状态下的环境中生长，尤其适于培养肝脏和心脏这种细胞密度比较大的实体器官。
Morgan 也开发了一款细胞三维培养皿，并且于 2009 年在布朗大学所在地普罗维登斯（Providence）成立了他自己的 Microtissues 公司。他们去年与 Sigma-Aldrich 公司达成了合作协议，由 Sigma-Aldrich 公司负责这款产品的销售工作。 Morgan 的客户主要也是大学的实验室和开展药物毒性筛查工作的制药企业，以及从事细胞治疗相关业务，比如培养移植用细胞组织团块的生物公司。
据 Morgan 介绍，他们之所以想到开发这款三维细胞培养皿，是因为 Morgan 当初与他的研究生 Anthony Napolitano 想在实验室里用细胞培养出多细胞的球形细胞团块。他们当时需要一种细胞不能够贴附的培养材料，可这一点恰恰是传统细胞培养器材无法满足的。而且他们还希望这种培养材料不要破坏细胞之间微弱的粘附力，因为细胞就是依靠这种相互作用粘附在一起的。最终他们的目光锁定在了琼脂糖（agarose）上。琼脂糖主要被用作合成水凝胶（hydrogel），我们知道水凝胶里98%都是水，所以 Morgan 在介绍他们的工作时会开玩笑地说道：“我们是在进行水‘雕’。”0 i& [8 h+ P  _0 v! X4 d: L
有人曾经将融化的琼脂糖制成微型培养板（micro-moulds），等琼脂糖凝固之后，再将这种琼脂糖材料放置到普通的培养板里。再在培养板里加入细胞和培养基，由于重力的作用，细胞会沉积到琼脂糖培养板里，彼此聚集在一起，形成球形的多细胞团块。这种琼脂糖培养板经过高压灭菌处理之后还可以重新再利用。
据 Morgan 介绍，这种微型培养板培养出来的球形细胞团块外形都比较均一，可以通过控制接种细胞的数量来控制球形细胞团块的大小。而且和使用生长支架的方式相比，使用这种方法培养的细胞更加容易收集，只需要将培养板倒过来就可以倒出细胞，非常方便。

美国得克萨斯大学（UniversityofTexas）的Mikhail Kolonin (图左)和AlexesDaquinag（图右）正在从事脂肪组织与干细胞方面的研究工作。7 n: q; w! b' R# B
更广阔的应用前景1 F) E6 E" Z& S
Primorigen 公司的 CEO Chuck Oehler 认为，虽然干细胞研究和细胞培养技术的发展日新月异，但是我们现在离细胞治疗还有相当长的一段距离。不过包括他们公司在内的诸多生物技术公司还是经常会接到干细胞治疗的要求。不过这可不是干细胞研究者希望看到的局面。  R9 Z) A5 t" l9 S; |8 c! G; b
有一位身患糖尿病的科研人员注射了 30 多年的胰岛素。几年前他接受了胰岛 β 细胞移植手术，手术后他有将近 1 年的时间没有注射胰岛素，同时他的病情也有所缓解，比如手指和脚趾的麻木感有所减轻。- t" E6 K  Z1 E+ h) j& P( z
“从我自己的切身经历就可以发现，细胞治疗技术拥有非常广阔的应用前景，只要我们这些科研人员能够生产出足够的、有活性的细胞。通过这次手术，我也真实地体会到了再生医学（regenerative medicine）对我自己，和我家人的生活质量带来了多么大的影响和改变。所以对于那些不了解我们这一行情况的患者和医护人员对我们的工作进展得如此缓慢表示出的不耐烦和焦急的心情，我也非常理解。”这位科研人员这样说道。作为第一批吃螃蟹的人，他真实地体会到了细胞培养技术的现实意义。
原文检索：
Vivien Marx. Cell culture: A better brew. Nature, 11 April 2013; doi:10.1038/496253a: q; S; p8 m1 y$ {9 \2 a' k% h- ]. a
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3楼原文感谢aulenuyah 提供

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